المبيضات البيض بيوفيلم التنمية على الهيئات الأجنبية طبيا ذات الصلة في الماوس تحت الجلد نموذج تلاه ضوء بارد التصوير

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقق من صحة استخدام سلالة لوسيفيراز للمراقبة غير الغازية لتكوين الأغشية الحيوية في الجسم الحي بواسطة خلايا المبيضات ألبيكان. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع شظايا القسطرة المستمرة ب luciferase تعبر عن سلالة المبيضات البيضاء في الجزء الخلفي من الفأر. خلال الخطوة الثانية ، يسمح للخميرة بالنمو إلى طبقة سميكة من الخلايا المضمنة داخل مصفوفة خارج الخلية ، مما ينتج عنه غشاء حيوي ناضج داخل القسطرة.

بعد ذلك ، تتم إضافة الركيزة التي سيتم تحويلها بواسطة إنزيم لوسيفيراز. ينتج هذا التفاعل ضوءا قابلا للقياس ، ثم يتم استخدام BLI لتسجيل وتحديد تكوين الأغشية الحيوية داخل المضيف الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الأخرى الموجودة ، مثل نظام Venmo المركزي ، هي أنه يمكننا اختبار ما يصل إلى ستة أغشية حيوية داخل واحد ، وبالتالي تقليل عدد التي نحتاجها للتحليل الإحصائي بشكل كبير.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج تكوين الأغشية الحيوية المبيضات البيضاء حيث تسمح طريقتنا باختبار المكونات المضادة للفطريات الحالية والجديدة. أيضا ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للمبيضات البيضاء ، الأغشية الحيوية الفطرية. يمكن أيضا تطبيقه على الميكروبات الأخرى مثل البكتيريا أو الأنواع الممتعة الأخرى.

الإجراءات المقترحة سهلة التنفيذ في أي مختبر لديه إمكانية الوصول إلى منشأة حيوانية قبل 24 ساعة من الإجراء الجراحي ، وفتح العبوة التي تحتوي على القسطرة ثلاثية التجويف داخل خزانة السلامة البيولوجية. استخدم ملاقط معقمة لإزالة جميع الأجزاء غير الضرورية ومشرط معقم لقطع الجزء المتصل بالقسطرة. ثم ضع مسطرة تحت العبوة البلاستيكية وقم بتقطيع قسطرة البولي يوريثين إلى قطع بطول سنتيمتر واحد.

بعد ذلك ، املأ كل قسطرة بحوالي 1.8 مل من مصل الأبقار الجنيني بنسبة 100٪ واحتضان القطع عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، قم بنقل كل قطعة قسطرة مطلية بالمصل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 مليلتر ، وكشط C albicans من لوحة A YPD إلى مليلتر واحد من PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل عند تخفيف واحد إلى 100. بعد العد ، قم بتخفيف تعليق الخلية إلى تركيز نهائي خمسة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر.

وأضف ملليلتر واحد من الخلايا إلى كل قطعة من قطع القسطرة المغلفة بالمصل. اسمح للخلايا بالالتصاق بالقسطرة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم أمسك الأنابيب في وضع رأسي باستخدام ملاقط معقمة.

اغسل كل قطعة برفق من خلال التجويف مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS لوضع القسطرة. ابدأ بحلق الجزء السفلي من ظهر أنثى فأرة مخدرة تبلغ من العمر ثمانية أسابيع موضوعة على وسادة تدفئة. ثم قم بتطهير الجلد وقم بعمل شق صغير من 0.5 إلى سنتيمتر واحد على كل جانب من جوانب.

بعد ذلك ، قم بتشريح النحاس الفرعي بالمقص لإنشاء نفقين تحت الجلد يبلغ طولهما حوالي 1.5 سم وعرض سنتيمتر واحد. أدخل ثلاث قطع قسطرة في كل نفق للتأكد من أن القطع تقع بجانب بعضها البعض في ترتيب أفقي دون تداخل. أغلق الشقوق بالخيوط ثم نظف الجروح برفق شديد باستخدام مطهر.

ثم ضع مخدرا موضعيا مباشرة على الشقوق وقم بإعطاء عامل تخدير عكسي يراقب حتى تتعافى تماما. لتصوير تكوين الأغشية الحيوية في النقطة الزمنية التجريبية المناسبة ، قم بحقن 100 ميكرولتر من الملف المحضر حديثا والتيريزين تحت الجلد في كل منطقة تحتوي على القسطرة في مخدر. ثم احصل على عمليات مسح متتالية بأوقات اكتساب تتراوح من 20 إلى 60 ثانية حتى يتم الوصول إلى أقصى شدة للإشارة.

أثناء الحصول على الإطار التالي ، ضع منطقة اهتمام على كل ثلاثي من القسطرة لقياس التصوير الحيوي أو شدة إشارة BLI للإطارات المكتسبة سابقا. ضع منطقة مستطيلة ذات أهمية ثابتة على منطقة تحكم أيضا لقياس إشارة الخلفية في برنامج الصور الحية. قم بقياس تدفق الفوتون عبر مناطق الاهتمام لكل ثلاثي قسطرة وكذلك للخلفية.

بعد تكرار هذه القياسات لكل وفي نقاط زمنية مختلفة أثناء تقرير تكوين الأغشية الحيوية ، فإن شدة إشارة BLI لكل ثلاثي قسطرة كتدفق فوتون في الثانية. يمكن نسخ البيانات ولصقها مباشرة في برنامج جداول البيانات. في نهاية التجربة الطولية ، ضحي بكل يقطع الأنسجة تحت الجلد واستخدم ملاقط معقمة لإزالة شظايا القسطرة واحدة تلو الأخرى.

اغسل القسطرة مرتين في مليلتر واحد من PBS كما هو موضح للتو. ثم صوتنة القطع في أنبوب طرد مركزي صغير جديد في مليلتر واحد من PBS الطازج عند 40،000 هرتز في حمام مائي. بعد 10 دقائق ، ضع الأنابيب التي تحتوي على القسطرة على الثلج وقم بلوحة 100 ميكرولتر من العينات الأصلية عند واحد إلى 10 وواحد إلى 100 مخفف على ألواح أجار YPD.

في مكررين. أخيرا ، ارسم المتوسط والانحراف المعياري لوحدات تشكيل المستعمرة. وإشارة BLI لكل على مقياس لوغاريتمي.

في هذه الصورة ، يظهر تمثيلي يعرض إشارة التلألؤ البيولوجي جنبا إلى جنب مع مناطق الاهتمام المشار إليها بعد ستة أيام من تطور الأغشية الحيوية. لاحظ عدم وجود إشارات في منطقة خلفية التحكم التي تؤكد قصر الأغشية الحيوية على المناطق المجاورة مباشرة للقسطرة المطلية بالكانديدا. في هذه التجربة التمثيلية ، يمكن ملاحظة إشارة BLI واضحة تنتجها الأغشية الحيوية التي تعبر عن اللوسيفيراز ، بينما يبدو أن إشارة الخلفية فقط هي التي يتم إنتاجها بواسطة سلالة النوع البري.

هذه الزيادة في الإشارة نفس اتجاه الزيادة في وحدات تشكيل المستعمرة لكل غشاء حيوي وقياسات تدفق الفوتون لكل مجموعة من مجتمعة. توضح هذه البيانات أن BLI هي تقنية قوية لمراقبة وقياس تكوين الأغشية الحيوية الناضجة C albicans في الجسم الحي في نموذج فأر تحت الجلد. بمجرد إتقان إصابة الأجهزة بخلايا المبيضات قد تستغرق ساعتين ، بينما يمكن إجراء زرع القسطرة في 10 دقائق لكل فأر.

يمكن إجراء تصوير BLI في خمس دقائق لكل فأر. الميزة الكبيرة لاستخدام BLI هي أنه يمكنك مراقبة تطور الكتلة الحيوية والأغشية الحيوية بشكل متكرر في نفس. بمرور الوقت بعد هذا الإجراء ، يمكن أن توفر طرق أخرى مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب معلومات عن موضع الكاتدرائية بالضبط.

يمكن بعد ذلك استخدام هذه المعلومات للقياس الكمي في نماذج أكثر تعقيدا مثل نموذج كاتدرائية الوريد العميق. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد جدا لكيفية الأداء في الجسم الحي ، والأغشية الحيوية تحت الجلد ، و ss في الفئران ، وقد يشكل هذا الأساس لمزيد من التحليل المتعمق لتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة.