الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد شركاء تفاعل البروتين لبروتين ذي أهمية باستخدام مقايسة تكملة جزء بروتين اختزال حمض الفوليك المائي DI ، أو D-H-F-R-P-C-A. يتم تحقيق ذلك عن طريق تكثيف مجموعة DH FFR F الثلاثة أولا أو الثناء على مصفوفات المستعمرات عالية الكثافة. بعد ذلك ، يتم تصنيع سلالة الطعم بمجموعة من الثناء على الوسط الغني.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تحديد ثنائي الصبغيات الناتج عن هذه التزاوج. في النهاية ، يتم قياس إعادة تشكيل DHFR عن طريق قياس أحجام المستعمرات على وسط PCA الانتقائي ، والذي يعطي إشارة تتناسب مع كمية مركب فريسة الطعم المعاد تشكيله في الخلايا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج أمراض مثل السرطان ، كما هو الحال من خلال إعادة توصيل شبكات تفاعل البروتين.

أن الطفرات يمكن أن تؤدي إلى مثل هذه الأمراض. في صباح يوم الإجراء ، قم بتعقيم المنصة الروبوتية عن طريق نقع أدوات PIN أولا خمس مرات لمدة 10 ثوان في محطة الحمام المائي لإزالة أي كتل خلايا متبقية. ثم انقع أداة PIN مرتين ذهابا وإيابا في محطة الفرشاة ومرتين في محطة تقديم الطعام لمدة 20 ثانية لكل منهما لإزالة أي من الخلايا المتبقية أثناء تنظيف أدوات PIN.

قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق لتعقيم الروبوت. قم بالضميمة ثم بعد الغسيل الأخير ، جفف أدوات PIN في محطة مجفف الهواء لمدة 25 ثانية. قم بتكثيف مجموعة A-D-H-F-R على 16 مصفوفة من 384 سلالة هنا.

يمكن تقسيم المصفوفة 384 إلى أربعة أرباع متباعدة متساوية الفائدة ، يتكون كل منها من 96 موضعا في تخطيط مصفوفة اثنين في اثنين ليصبح المجموع أربعة أرباع. للقيام بذلك لكل مصفوفة 384 ، قم بطباعة أربع لوحات جلسرين على الأرباع الأربعة من صينية شاملة تحتوي على YPD بالإضافة إلى 250 ميكروغرام لكل مليلتر. Hygromycin B ، باستخدام أداة 96 دبوس للقيام بذلك ، أدخل 4 96 لوحة بئر تحتوي على LDH FFR F ثلاثة تحكم سلبي بين 60 لوحة جلسرين من مجموعة DHFR الثلاثة من أجل الحصول على مجموعة نهائية من 64 لوحة تملأ بالضبط أربعة 1 ، 536 مصفوفات.

ثم أدخل 4 96 لوحة بئر تحتوي على LDH FFR F ثلاثة تحكم سلبي بين 60 لوحة أخرى للحصول على مجموعة نهائية من 64 لوحة تملأ بالضبط 4 15 36 صفيف قبل إضافة الخلايا إلى لوحات المصدر ، بلل المسامير المعقمة في 35 مل من الماء المعقم في صينية omni في المحطة الرطبة. احتضان المصفوفات عند 37 درجة مئوية لمدة يومين ، ثم قم بتكثيف المجموعة في أربعة مصفوفات من 1،536 سلالة. اطبع أربع صفوفات من 384 سلالة على كل لوحة من لوحات الوجهة الأربعة.

باستخدام أداة 384 دبوس. تعقيم أداة PIN بين كل دورة نسخ متماثل كما هو موضح للتو بعد حضانة يومين آخرين. قم بتوحيد حجم المستعمرة عن طريق تكرار المصفوفات الأربعة على وسط YPD المحدد باستخدام أداة 1 ، 536 دبوس واحتضان الألواح لمدة 48 ساعة أخرى.

لإنتاجية عالية. D-H-F-R-P-C-A قم أولا بتلقيح ثقافة سلالة الطعم في 20 مل من YPD السائل بالإضافة إلى CIO ricin في أنبوب سعة 50 مليلتر واحتضان الخلايا لمدة يومين عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. عندما تصل الثقافة إلى التشبع.

ضع خمسة ملليلتر من تعليق الخلية على صينية YPD plus omni ، واترك الخلايا تمتص على السطح بعد خمس إلى 10 دقائق ، وقم بإزالة السائل الزائد واحتضان الثقافة عند 30 درجة مئوية بعد يومين. استخدم أداة 1 ، 536 دبوس لطباعة سلالة الطعم على 12 لوحة YPD باستخدام كل حديقة خلية لا تزيد عن أربع مرات. ثم باستخدام أداة 1 ، 536 دبوس ، مرة أخرى ، اطبع المصفوفة المناسبة لمجموعة DHFR F الثلاثة أعلى خلايا الطعم.

دع السلالات تتزاوج خلال حضانة يومين أخرى ثم حدد الخلايا ثنائية الصبغيات عن طريق طباعة المستعمرات على صواني متعددة الأنواع تحتوي على YPD بالإضافة إلى hydromycin B و nortin. احتضن ثنائي الصبغيات لمدة يومين آخرين عند 30 درجة مئوية ، ثم كرر الاختيار كما هو موضح للتو بعد يوم واحد من الحضانة. صب الأطباق مع الوسائط التي تحتوي على الميثوتريكسات في اليوم التالي.

استخدم الأداة 1 ، 536 دبوس لطباعة الخلايا ثنائية الصبغيات على وسط الميثوتريكسات واحتضان الألواح لمدة أربعة أيام أخرى في أكياس بلاستيكية لمنع المزارع من الجفاف. في اليوم الثالث من الحضانة. صب دفعة ثانية من صواني omni التي تحتوي على وسيط MTX كما هو موضح للتو في اليوم التالي ، وقم بتشغيل ضوء الروبوت واستخدم منصة آلية لتصوير اللوحات لتقليل نمو الخلفية لسلالات PCA ولزيادة الدقة الكمية ، وتكرار الخلايا على الدفعة الثانية من وسائط MTX لإجراء جولة ثانية من اختيار MTX كما هو موضح للتو.

أخيرا ، بعد الحصول على صور من المجموعة الثانية من اللوحات ، قم بتحليل مصفوفات المستعمرة باستخدام البرنامج المناسب ، وجمع معلومات حجم المستعمرة لكل موضع من كل مصفوفة. يمكن استخدام العتبة المحددة باستخدام عناصر التحكم الثلاثة LDH FFR F كعتبة تجريبية لتحديد نتائج الثقة العالية. يمكن بعد ذلك استرداد التفاعلات المادية المعروفة للطعم من قواعد البيانات مثل Biogrid وتراكبها على البيانات.

على سبيل المثال ، هنا ، تم الإبلاغ سابقا عن خمس من أصل ثماني ضربات عالية الثقة على أنها متفاعلات NUP 82 ، من بينها NUP one 16 و NUP 1 59 تم تحديدها لتكون جزءا من مجمع NUP 82 الفرعي. تشير البيانات أيضا إلى أن بروتين الغشاء التقريبي PEX 30 قد يمثل تفاعلا فيزيائيا جديدا ل Nup 82 كما تم تأكيده باستخدام D-H-F-R-P-C-A بإنتاجية منخفضة تم اكتشاف اثنين من شركاء التفاعل الآخرين. تم تحديد الجديدين 20 و 85 الجديدين على أنهما ليسا جزءا من المركب الفرعي الجديد 82 ، مما يوضح قدرة D-H-F-R-P-C-A على اكتشاف التفاعلات داخل وبين المجمعات الفرعية للمجمعات الأكبر.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر استخدام وسائط Freshly Report لتجنب أي استكشاف الأخطاء وإصلاحها في خطوات الطباعة، وتضمين عناصر التحكم اللازمة للتأكد من أن وسائط PCA النهائية تمكن من نمو الخلايا التي توضح تكامل DHFR فقط.