التمهيدي لالمناعية على نسيج Cryosectioned دماغ الفئران: مثال تلطيخ لالدبقية الصغيرة والخلايا العصبية

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام الكيمياء النسيجية المناعية من أجل تصوير البروتينات المستهدفة. في هذا المثال، تم استخدام IBA1 للخلايا الدبقية الصغيرة و pan neuronal للعصبونات. ويتحقق ذلك أولاً بوضع المقاطع المُحضرة في محلول حجب لمنع الارتباط غير النوعي.

كخطوة ثانية، توضع الأجسام المضادة التي تتعرف على البروتينين المختلفين المستهدفين على المقاطع طوال الليل. بعد ذلك، تُغسل المقاطع وتُحضن في أجسام مضادة ثانوية من أجل إضافة علامات فلورية إلى الأجسام المضادة الأولية. ويمكن لنتائج الوسم المزدوج أن تحدد صبغات الخلايا الدبقية الصغيرة ضمن حقول الخلايا العصبية.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه التقنية صعوبة في البداية نظراً لوجود العديد من المتغيرات التي تتطلب ضبطاً. ستقوم Hazel May، وهي طالبة في مرحلة البكالوريوس في مختبرنا، باستعراض هذه التقنية اليوم. للبدء، قم بتثبيت وتقطيع أدمغة القوارض بعناية كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب، ثم احفظها بعناية في درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت استخدامها.

عندما تكون مستعداً لمتابعة البروتوكول، أخرج الشرائح من المجمد واتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد ذوبانها، ضع الشرائح في حامل واغسلها ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. ومن هذه النقطة فصاعداً، لا تترك المقاطع تجف.

قم بتجفيف حواف الشرائح ورسم حدود طاردة للسوائل حول حافة الشريحة باستخدام قلم pap لضمان تغطية متساوية للسائل وتقليل تأثيرات الحواف. بعد ذلك، قم بحجب المقاطع بإضافة 300 µL من المصل في PBS إلى كل شريحة. يجب أن يكون المصل مستخلصاً من النوع الذي تم إنتاج الجسم المضاد الثانوي فيه.

في هذه الحالة، تم استخدام مصل الحمير. تأكد من وصول محلول الحجب إلى حافة الشريحة وتغطيته للنسيج بالكامل. ولتجنب التلوين غير المتساوي، ضع الشرائح في غرفة رطوبة للتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

أثناء فترة الحضانة، قم بتحضير الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الجسم المضاد IBA1 بنسبة 1 إلى 5,000، والجسم المضاد pan neuronal بنسبة 1 إلى 500 في خليط من مصل الحمير بنسبة 1% في محلول PBS. قم بإزالة محلول الحجب وأضف 300 µL من محلول الأجسام المضادة الذي يحتوي على كلا الجسمين المضادين المطلوبين. كما يجب تحضير ثلاث شرائح ضابطة.

أضف 300 µL من تخفيف IVA وحده إلى شريحة واحدة، و 300 µL من تخفيف الجسم المضاد العصبي الشامل (pan neuronal antibody) وحده إلى شريحة ثانية، و 300 µL من مصل الحمير بتركيز 1% في PBS إلى شريحة ثالثة. ضع جميع الشرائح في غرفة رطوبة وحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في الصباح التالي، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة.

قم بتحضير خليط الأجسام المضادة الثانوية الفلورية عن طريق تخفيف كل منهما بنسبة 1 إلى 250 في مصل حمير بتركيز 1% في محلول PBS. أضف 300 µL من الخليط إلى كل شريحة، وضع الشرائح في غرفة رطوبة محكمة الإغلاق ومعتمة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الشرائح ثلاث مرات في محلول PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة، وأخيراً، اشطفها بالماء المقطر المزدوج.

احمِ الشرائح من الضوء أثناء الغسيل. وفي محلول PBS، أضف بضع قطرات من وسط تثبيت مائي يساعد في الحفاظ على كثافة الإشارة الفلورية إلى كل شريحة. ثم غطِّ الشريحة بغطاء زجاجي وأزل أي فقاعات هواء متبقية باستخدام مسحة قطنية لإحكام تثبيت وسط التثبيت على الشرائح ومنع جفاف المقاطع.

قم بتغطية الحواف بطلاء الأظافر. تُترك الشرائح لتجف بشكل مسطح لمدة ساعة واحدة في صندوق محمي من الضوء قبل تخزينها في حاوية محكمة الإغلاق ضد الضوء ومغلفة بورق القصدير عند درجة حرارة 4 °C. وبمجرد جفاف طلاء الأظافر، انقل الشرائح إلى غرفة المجهر من أجل التصوير.

قم بتجهيز الغرفة عن طريق إطفاء الأضواء العلوية وحجب أي مصادر ضوء خارجية أخرى. قم بتشغيل المجهر، ومصدر الضوء الفلوري، وجهاز كمبيوتر التصوير. ثم ضع شريحة على منصة المجهر واضبط التركيز البؤري.

باستخدام البرنامج المرفق، قم بضبط زمن التعريض لكل طول موجي على حدة. تجنب تعريض الشريحة للضوء لفترات طويلة لمنع حدوث التبييض الضوئي (photobleaching) للعينة. بعد ذلك، قم بالتقاط الصور في كل قناة دون تحريك المقطع أو ضبط التركيز.

قم بدمج الصور باستخدام برنامج التصوير واحفظها لتحليل الصور لاحقاً. وباستخدام بروتوكول التلوين المذكور للتو، يمكن الحصول بسهولة على صور فلورية مثل تلك الموضحة هنا؛ حيث تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ IBA one بوضوح في القناة الحمراء، وتبرز الخلايا العصبية الموجبة لـ pan neuronal فوق الخلفية في القناة الخضراء. وتظهر أيضاً الصور الضابطة لكلا صبغتي الأجسام المضادة هاتين.

يوضح الوسم المزدوج المظلم باستخدام IBA one وعلامة عصبية شاملة الموضحة هنا وجود خلايا دبقية صغيرة متفرعة في الغالب مع بروز نتوءات عصبية دقيقة وطويلة واضحة عبر الطبقات القشرية. كما أن نتائج صبغ مثل تلك الموضحة هنا تكون ممكنة إذا كانت جودة النسيج رديئة. وتتضح جودة النسيج الرديئة من خلال غياب أجسام خلوية محددة بوضوح وتجزؤ في استطالات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية.

هناك نقص في وضوح صبغ الخلايا الدبقية الصغيرة وغياب تام لصبغ الخلايا العصبية، مما يجعل الصورة المتراكبة غير ذات جدوى عند محاولة تطبيق هذه التقنية. من المهم تغطية المقاطع بشكل متساوٍ والتذكر بعدم السماح بجفافها بين الخطوات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لتقنيات الكيمياء النسيجية المناعية التمهيدية.