ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

الهدف من التجربة التالية هو أن تكون قادرا على تصوير الجزيئات الكبيرة في حالتها الرطبة المجمدة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل. يتم تحقيق ذلك عن طريق غمر الشبكة بالفلاش مع العينة على المبردة للحصول على عينة زجاجية رقيقة. كخطوة ثانية ، تتعرض العينة لحزمة الإلكترون ، والتي ستشكل صورة إسقاط للجزيئات الكبيرة.

بعد ذلك ، تتم معالجة الصور على الكمبيوتر من أجل الحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لجزيء الماكرو. تظهر النتائج بنية ثلاثية الأبعاد مفصلة للغاية للجزيء الكلي ، وتأكيده ، والموقع ثلاثي الأبعاد لشركائه الجزيئيين. هناك ميزة رئيسية لهذه التقنية ، وهي طرق أخرى لإعداد العينات للفحص المجهري.

في التبريد ، تتشكل الصورة مباشرة بواسطة الإلكترونات داخل الجزيء الكبير. هذا يعكس بشكل أكثر أمانة ، هيكله الأصلي القريب. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية.

يصعب تعلم إعداد شبكة التبريد ونقلها إلى المجهر الإلكتروني بسبب المضاعفات الإضافية عند العمل في درجات حرارة مبردة ، يتم استخدام دورة الإحماء في بداية تسلسل الضخ وبعد جلسة التبريد EM. لبدء هذا الإجراء ، أدخل حامل التبريد في أحد منافذ الضخ في محطة الضخ. ابدأ خيار دورة الإحماء.

في وحدة التحكم في المرحلة الباردة ، افتح صمام الفراشة V اثنين ، وعندما يستقر الفراغ في محطة الضخ التوربيني ويقرأ 10 إلى الجولة الثالثة ناقص ، أو من الأفضل فتح صمام الفراشة V واحد. بمجرد أن تكون درجة الحرارة في الحامل مستقرة فوق درجة حرارة الغرفة وتكتمل دورة الإحماء. أدنى مستوى V واحد وإيقاف الدورة.

بعد ذلك ، ابدأ خيار دورة ضوء ze وحدد الوقت اللازم للحصول على فراغ جيد في حدود واحد إلى اثنين في 10 إلى ناقص أربعة تور. عندما يصل الفراغ إلى 10 إلى سالب ثلاثة لنطاق، افتح صمام تفريغ المنضب المنضب B ثلاثة والصمام الموجود على حامل التبريد. عند اكتمال الدورة ، رفعت الصمامات بالترتيب المعاكس الذي تم فتحها به.

باستخدام زوج من الملقط ، اترك قطعة من MICA لكشف سطحين جديدين. ضع أسطح الميكا المكشوفة الجديدة ووجهها لأعلى على قطعة بيضاء من الورق في طبق بتري. بعد وضع طبق بتري في وعاء مبخر الكربون ، قم بإجراء تسلسل المضخة لأسفل حتى يصبح الفراغ أقل من 10 إلى سالب ستة ، قم بتغطية الميكا بطبقة رقيقة من الكربون.

ثم انقل الكربون الرقيق إلى الشبكة. أن قطعة 0.5 × سنتيمتر واحد من الميكا المطلية وتعويم الكربون على السطح المسطح للمياه منزوعة الأيونات المفلترة. باستخدام الملقط ، ضع جانب الكربون المقدس للشبكة على اتصال بالسطح العلوي لطبقة الكربون العائمة والتقطه.

ضع الشبكة بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى على شريحة زجاجية مقاس 7.5 × 2.5 سم مغطاة بغشاء كهربائي. ثم ضع الشريحة الزجاجية في غرفة معدات تفريغ التوهج وأغلق الغرفة. ضخ جرة الجرس وتوهج.

التفريغ لمدة 20 ثانية عند 25 مللي أمبير وسبع مرات 10 إلى سالب ملليبار. في هذه المرحلة ، قم بتشغيل جهاز التجميد الغاطس. اسحب حاوية إيثان لأسفل عن طريق ملء الخزان بالنيتروجين السائل.

بمجرد أن يتوقف النيتروجين السائل عن الغليان ، ضع طرف الأنبوب القادم من خزان إيثان في الغرفة الداخلية وافتح الصمام ببطء شديد. قم بتسييل الإيثان في الغرفة الداخلية واملأه إلى ملليمتر واحد من الأعلى. قم بتشغيل الرطوبة.

بعد ذلك ، قم بتحميل شبكة على ملاقط وقم بتحميل ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من العينة على سطح الكربون للشبكة المقدسة. بعد انتظار امتصاص العينة للشبكة ، قم بإجراء النشاف للحصول على طبقة رقيقة من أحمر الخدود السائل ، قم بتجميد الشبكة عن طريق غمرها في الإيثان السائل. قم بإزالة مجموعة شبكة الملقط بعناية من الإيثان السائل وانقله إلى الغرفة الخارجية التي تحتوي على النيتروجين السائل.

ثم انقل الشبكة إلى صندوق شبكي صغير مغمور في النيتروجين السائل. في هذه المرحلة ، أدخل حامل التبريد في محطة عمل النقل بالتبريد. املأ عامل حامل التبريد ووعاء محطة العمل بالنيتروجين السائل.

انقل صندوق شبكة التبريد الذي يحتوي على الشبكة الرطبة المجمدة بسرعة إلى النيتروجين السائل في محطة العمل. بعد فتح صندوق شبكة التبريد ، خذ الشبكة الرطبة المجمدة وضعها في فتحة حامل العينة. بعد ذلك ، ضع حلقة القصاصة أعلى الشبكة واضغط عليها برفق بالطرف الحاد لأداة حلقة المشبك وحتى تستقر في مكانها بإحكام.

ثم أغلق غالق التبريد. قم بإزالة TEM المضاد للتلوث بالنيتروجين السائل. أعد إمالة مرحلة المجهر إلى 60 درجة تحت الصفر.

بعد ذلك ، ابدأ دورة غرفة معادلة الضغط PrepU على المجهر. بمجرد الانتهاء من تسلسل غرفة معادلة الضغط للمضخة ، أدخل حامل الجوقة في غرفة معادلة الضغط وقم بتوصيل سلك التحكم في المرحلة الباردة بالحامل لمراقبة درجة الحرارة. بعد إطفاء الضوء الأحمر ، قم بتدوير الحامل إلى موضع درجة الصفر لإدخاله في عمود الفراغ العالي في T EM.

اسحب غالق التبريد وافتح صمامات العمود. قم بتنشيط برنامج الجرعة المنخفضة في وضع البحث. قم بتوسيط المسرح وتعيين الارتفاع المركزي باستخدام متذبذب ألفا لهز المسرح زائد أو ناقص 15 درجة ، وحدد ثقبا مناسبا وضعه في وسط الحقل باستخدام وحدة التحكم في المرحلة XY.

قم بالتبديل إلى وضع التركيز البؤري وركز الصورة. ثم تحت التركيز على الصورة بين 0.5 و 4.5 ميكرون. قم بالتبديل إلى وضع التعريض وتسجيل الصورة.

أخيرا ، ارجع إلى وضع البحث لتحديد الفتحة التالية وتكرار التسلسل. تتم مقارنة الصور المجهرية التي تم الحصول عليها بطرق التلوين السلبي و cryo EM لأربع عينات تمثيلية ذات خصائص هيكلية مختلفة هنا تكشف قفيصة الفيروس المرتبطة بالغدة الملطخة سلبا عن جزيئات شبيهة بالفيروسات ويظهر cryo EM أنها فارغة. تظهر صور فيروس فسيفساء التبغ قضبان حلزونية مع القناة المركزية مملوءة بالبقع في التلوين السلبي وفارغة في صور التبريد

يتجمع KLH في براميل مميزة تظهر ستة تشققات في كل من التلوين السلبي وصور EM بالتبريد. تكشف المناظر الجانبية المستطيلة والمناظر الدائرية والدائرية عن فراغ في هيكل بواسطة cryo EM في مستقبل السبحة. تتجلى ميزات السطح المعقدة مثل الصليب المركزي والمنخفض المركزي في تراكم البقع عن طريق التلوين السلبي وكمناطق منخفضة الكثافة بواسطة التبريد.

الأمثلة النموذجية للقطع الأثرية بالتبريد هي الجليد البلوري ، وتلوث الجليد ، واللابؤرية ، والهياكل الشبيهة بالويب. يكشف تحليل الجسيمات المفردة وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد لمستقبلات الجسيمات المائية المجمدة عن هيكلها المتماثل رباعي الأضعاف. يشكل المجال السيتوبلازمي منشورا مربعا ويحتوي على العديد من المجالات الحلقية القابلة للتكرار التي تشكل بنية تشبه السقالة.

بدقة 10 أنجستروم ، من الممكن تصور ألفا هيلوك 3D. يمكن أن يكشف رسم خرائط الفرق عن موضع الروابط المهمة. توفر التغييرات التأكيدية رؤية ديناميكية للجزيء الكلي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات EM عالية الجودة. مكن Cryo EM جنبا إلى جنب مع معالجة الصور الباحثين من استكشاف تنظيم الوحدة الفرعية للهيكل والديناميكيات التوافقية للآلات الجزيئية الكبيرة.