عينة استراتيجيات التحضير للتصوير الطيف الكتلي لل3D الثقافة خلية نماذج

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير مستنبتات خلوية ثلاثية الأبعاد وتحليلها باستخدام التصوير بطيف الكتلة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء مستنبتات خلوية ثلاثية الأبعاد وتركها تنمو حتى تصل إلى الحجم المطلوب. وتتمثل الخطوة الثانية في حصاد المستنبتات الخلوية ثلاثية الأبعاد وطمرها في الجيلاتين.

بعد ذلك، يتم تقطيع المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد عند درجة حرارة -30 °C باستخدام جهاز الميكروتوم المبرد (cryostat)، ثم تُثبّت على شرائح موصلة. وتتمثل الخطوة النهائية في تحليل المقاطع باستخدام جهاز Maldi MSI وإجراء تحليل للجزيئات المكتشفة. وفي الختام، يُستخدم تصوير مطيافية الكتلة لإظهار التغيرات في توزيع المواد التحليلية للعديد من الفئات المختلفة من الجزيئات الحيوية عبر المزرعة الخلوية ثلاثية الأبعاد.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بتقنيات أخرى مثل المجهر أو التصوير الشعاعي الذاتي، في أن تصوير طيف الكتلة يتيح الكشف عن عدة مواد تحليلية وتحديد مواقعها، مثل البروتينات والدهون والأدوية والمستقلبات في تجربة واحدة دون الحاجة إلى وسم مناعي. سيقوم بتوضيح هذا الإجراء كل من دوروثي ألف ويثكرافت، وأنا، وباحث ما بعد الدكتوراه، وشين لي، وهو طالب دراسات عليا من مختبر هامان. قبل البدء في هذا الإجراء، قم باستزراع خط خلوي مناسب، مثل خط خلايا سرطان القولون HCT 116، في مستنبت أحادي الطبقة ثنائي الأبعاد. بعد ذلك، أضف 0.19 grams من aros إلى 10 milliliters من الوسط القياسي في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliters.

تأكد من الدمج عن طريق الخلط اللطيف، ثم قم بتعقيم Agros بجهاز الأوتوكلاف في حمام مائي لمدة 20 دقيقة. وباستخدام ماصة متعددة، اسحب 50 µL من خليط وسط Agros ووزعها في الآبار المركزية الـ 60 من لوحة زراعة ذات 96 بئرًا وقاع مسطح. ونظراً لأن الآبار الموجودة عند الحواف المحيطية للوحة تعاني من معدلات تبخر أعلى قليلاً، أضف 200 µL من phosphate buffered saline بتركيز 1x إلى هذه الحواف بدلاً من Agros.

بمجرد إضافة خليط aros إلى الآبار الداخلية، تُترك الصفيحة جانباً لتبرد إلى حوالي 37 درجة Celsius قبل إضافة الخلايا. في هذه المرحلة، يُضاف 200 µL من محلول الخلايا المناسب إلى صفيحة 96 بئراً مطلية بـ aros، ثم تُغطى الصفيحة وتوضع في حضانة رطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند 37 درجة Celsius لنمو الخلايا. وبعد انتهاء فترة التحضين، يتم تغيير الوسط الغذائي عن طريق شفط الوسط القديم بعناية من حول المزرعة الخلوية ثلاثية الأبعاد الصغيرة الموجودة في قاع aros.

ثم أضف 200 µL من الوسط الغذائي الطازج برفق فوق المزرعة الخلوية ثلاثية الأبعاد. قم بتحضير محلول من الجيلاتين بتركيز 175 mg/mL تقريبًا في ماء عالي النقاء. اخلط الجيلاتين بقوة بعد أن يصبح المحلول لزجاً ويصعب التعامل معه.

ضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 60 درجة مئوية تقريبًا حتى يصبح المحلول رائقًا وسهل السحب. وباستخدام ماصة سيرولوجية سعة 2 مل، ضع 0.6 مل من محلول الجيلاتين الدافئ في آبار طبق مسطح القاع يحتوي على 24 بئرًا. ضع المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد المغسولة فورًا فوق طبقة الجيلاتين باستخدام ماصة أخرى سعة 2 مل لتجنب تمزيق البنية ثلاثية الأبعاد.

بعد وضع المزارع الخلوية على سطح طبقة الجيلاتين، قم بنقل 0.6 milliliters أخرى من خليط الجيلاتين الدافئ بعناية باستخدام الماصة فوقها، وذلك لضمان عدم تحريكها من موضعها. بعد ذلك، يتم التجميد. تُجمد المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد المدمجة في الجيلاتين عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius.

بمجرد إخراج طبق الـ 24 عينًا الذي يحتوي على المزارع الخلوية من المجمد، قم بتدفئة الجزء السفلي من الطبق بيدك حتى تنزلق الملاقط بلطف على جانب العين. بعد ذلك، حرك الملاقط بسلاسة حول القرص، لتحرير الجيلاتين دون تذويب المركز.

أضف قطرة من الماء إلى حامل الميكروتوم المجمد (cryostat) وثبّت قرص الجيلاتين على الحامل. ثم ضعه في الميكروتوم المجمد للتجميد. بعد إزالة الجيلاتين الزائد للكشف عن المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد، قم بتقطيعها ببطء وبحركة سلسة في مقاطع تتراوح سماكتها من 12 إلى 16 µm.

بمجرد إذابة الشرائح، يتم تثبيتها على شرائح زجاجية مغلفة بأكسيد الإنديوم والقصدير. بعد تسمية الشرائح، تُحفظ في مجفف للكشف عن البروتينات السليمة. تُغسل الشرائح باستخدام الأسيتون البارد لإزالة الجزيئات الصغيرة مثل الدهون التي قد تحجب الإشارة.

قم بتحضير المصفوفة في محلول من مذيب عضوي وماء مع 0.1% من حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك. استخدم حقنة دقيقة الرأس لوضع 0.5 µL من محلول المصفوفة على شريحة المزرعة الخلوية ثلاثية الأبعاد. بعد السماح للمصفوفة بالتبلور، جفف الشرائح في مجفف لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إجراء تحليل Maldi MSI.

عند الوصول إلى مرحلة التحليل، يتم وضع الشرائح في محول مخصص لتثبيت الشرائح مقاس 75 ملم × 25 ملم بشكل آمن لتصوير شرائح المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد. ثم يتم تحميل محول الشرائح في الجهاز. وبعد تطوير طرق الحصول على البيانات المناسبة، يتم ضبط نطاق الكتلة للحصول على بيانات الجزيئات الصغيرة بين 101,000 m/z وللبروتينات بين 8,020 و 5,000 m/z.

بعد ذلك، قم بضبط قدرة الليزر وتردد عدد نبضات الليزر وحجم البقعة باستخدام محلول المعايرة وشريحة مستنبتة ثلاثية الأبعاد من الخلايا تكون مخصصة للتضحية ومجاورة للعينة. احفظ هذه الطريقة لاستخدامها في برنامج التصوير المقدم من الشركة المصنعة للجهاز. قم بتطوير طرق الحصول على بيانات البروتين للنطاق الكتلي المختار كما تم وصفه سابقاً.

ثم قم بضبط معاملات جهاز MS المحددة باستخدام برنامج التصوير. بعد اختيار معاملات الجهاز وتحديد موضع طريقة التحكم في الجهاز، حيث سيتم إجراء المسح فوق المزرعة الخلوية ثلاثية الأبعاد. بعد ذلك، اختر ثلاث نقاط تعليمية مناسبة على العينة مع نقل الليزر إلى كل منها.

بدورها، احصل على الصورة الضوئية من برنامج التحكم في ليزر maldi TOF باستخدام خاصية تصوير الشاشة (print screen). ثم ابدأ عملية التصوير من برنامج التصوير واجمع أطياف الكتلة من كل شريحة للتحليل المستهدف. قم بإجراء تحليل يدوي للأطياف من خلال النقر على كتلة في الطيف المتوسط.

أخيراً، قم بإجراء التحليل الإحصائي لمجموعات البيانات المستخرجة باستخدام برمجيات رياضية. يمتلك التصوير بطيف الكتلة القدرة على الكشف عن توزيعات جزيئية مختلفة عديدة في المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد. وباستخدام الطريقة الموصوفة سابقاً، يمكن تتبع الأنواع التي تتراوح من الجزيئات الصغيرة إلى البروتينات الكبيرة عبر المزرعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد وتقطيعها وتحليلها عن طريق التصوير الطيفي الكتلي.