الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة وبناء التنموي سمية فحوصات للسلامة الكيميائية الفحص وبيولوجيا الأنظمة توليد البيانات

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف نظامين لاختبار السمية التنموية في المختبر يعتمدان على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ودراسات النسخ. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أولا على الخلايا الليفية الجنينية للفأر. الخطوة الثانية هي إما السماح للخلايا الجذعية الجنينية البشرية بتكوين أجسام Embry حيث يمكنها توليد خلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث أو تمايزها إلى أسلاف الأديم العصبي الظاهري.

بعد ذلك ، يتم التعامل مع أجسام الجنين أو أسلاف الأديم الظاهر العصبي بمركبات ذات أهمية بتركيزات مختلفة أثناء التمايز. الخطوات النهائية هي تقييم صلاحية الخلايا وعزل الحمض النووي الريبي. في نهاية المطاف ، يتم استخدام تحليل المصفوفة الدقيقة للنسخ لإظهار التغييرات في تعبير الحمض النووي الريبي للخلايا المعالجة بمركب ذي أهمية مقارنة بخلايا التحكم غير المعالجة بناء على الخلايا الجذعية النيونية البشرية ومناطق الحمض النووي الكلية ، أنشأنا منهجية في المختبر تسمح بمراقبة تأثيرات السمية التنموية ذات الصلة بالإنسان.

يمكن تطبيق المنهجية من قبل الصناعة الدوائية والكيماوية لفحص سلامة الأدوية المحتملة والمواد السامة البيئية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السمية التنموية ، مثل تأثير المواد الكيميائية على النمو العصبي المبكر جدا. للبدء ، قم بإذابة المكمل الغذائي المتوسط للخلايا الجذعية في درجة حرارة الغرفة وأضف 100 مل منه إلى 400 مل من وسط الخلايا الجذعية القاعدية.

بعد ذلك ، قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد ، ثم أضف الحجم المكمل للمصفوفة إلى 24 مل من dmm المبرد. F 12 الوسط القاعدي على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة ، قم بخلط محلول عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل ، ثم أضف ملليلترين من الخليط إلى 12 لوحا منفصلا بحجم ستة سنتيمترات. احتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بينما تغطي المصفوفة الألواح.

ثم قم بإزالة الوسيط وأضف ملليلترين من وسط الخلايا الجذعية. بعد ذلك ، قم بإزالة أربع لوحات ملتصقة من الحاضنة التي تحتوي على جنين بشري. H تسع خلايا نمت على طبقات تغذية الانفجار الليفي الجنيني للفأر التي يتم تحضيرها كما هو موضح في بروتوكول intext المصاحب تحت مجسم ، استخدم طرف ماصة سعة مليلتر واحد وقم بإزالة المستعمرات المتمايزة من اللوحة.

المستعمرات غير المتمايزة لها حدود محددة جيدا والخلايا مضغوطة ، بينما تبدأ الخلايا المتمايزة في التكاثر من الحدود وتكون خلاياها أكبر في الحجم. استنشق الوسط واغسل الخلايا بأربعة ملليلتر من PBS. ثم أضف ملليلترين من وسط الخلايا الجذعية مع ثمانية من مجسم الجسم.

قم بتقطيع المستعمرات إلى ست إلى تسع قطع لكل منها بإبرة قياس 26 واكشط الكتل بأطراف ماصة واحدة من المليلتر. اجمع المستعمرات المقطوعة برفق في أنبوب صقر سعة 50 مليلتر وحبيبها عند 200 جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط snat وإعادة تعليق الخلايا في 12 مل من وسط الخلايا الجذعية.

ضع 20 ميكرولترا من تعليق الخلية على شريحة زجاجية واحسب عدد الكتل تحت المجهر. اضبط تركيز التعليق على 150 كتلة لكل مليلتر ثم أضف ملليلترين من التعليق في كل لوحة يبلغ طولها ستة سنتيمترات. حرك الصفائح ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر لتوزيع الخلايا بشكل موحد ، ثم احتضن الألواح في حاضنة زراعة الخلايا كل يومين.

قم بتغيير الوسط بعناية بعد إزالة المستعمرات المتمايزة ، أضف 40 ميكرولترا من محلول البوليمر المشترك المعقم بنسبة 5٪ إلى كل بئر من لوحة البئر Vbo 96 واتركها تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. قم بإزالة صفيحة متجانسة تحتوي على مستعمرات من الحاضنة واختر أي مستعمرات متمايزة تحت مجهر استريو بطرف ماصة سعة مليلتر واحد. ثم استنشق الوسط من اللوحة واغسل الخلايا برفق بأربعة ملليلتر من PBS.

بعد ذلك ، أضف ملليلترين من وسط التمايز العشوائي لكل لوحة. استخدم أداة المرور لقطع مستعمرات الخلايا التسع H في كتل ذات حجم موحد. اكشط الكتل باستخدام مكشطة خلية واجمعها برفق في جهاز طرد مركزي من أنبوب الصقر سعة 50 مل.

تتكتل المستعمرة عند 200 جم لمدة خمس دقائق ثم تستنشق الجرعة وتعيد تعليق الخلية ووسط التمايز العشوائي عند 1000 كتلة لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بشفط البوليمر المشترك للكتلة من صفيحة البئر 96 السفلية V بمساعدة ماصة متعددة القنوات ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق المستعمرة إلى كل بئر تجميع الكتل إلى قاع الآبار على شكل حرف V عن طريق الطرد المركزي للوحة عند أربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق عند 400 جم ، ثم ضع صفيحة في الحاضنة لمدة أربعة أيام باستخدام أطراف 200 ميكرولتر ذات تجويف أوسع. قم بإزالة أجسام الأجنة من صفيحة البئر 96 وضعها في صفيحة معقمة 122 ملم مربع.

بعد ذلك ، استخدم ماصة مصلية معقمة سعة 10 ملليلتر لنقل أجسام الجنين من الصفيحة المربعة إلى أنبوب صقر سعة 15 ملليلترا. اسمح لأجسام الجنين بالاستقرار لمدة دقيقتين ثم استنشق الجنين واغسل أجسام الجنين بخمسة ملليلتر من PBS. مرة أخرى ، انتظر حتى تستقر أجسام الجنين لمدة دقيقتين ثم استنشق المادة الطافية.

هذه المرة أعد تعليق أجسام الجنين في خمسة ملليلتر من وسط التمايز العشوائي. بعد ذلك ، انقل أجسام الجنين إلى صفيحة بكتريولوجية يبلغ طولها 10 سم وأضف 10 ملليلتر إضافي من التمايز العشوائي. متوسط. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 على شاكر أفقي.

عند 50 دورة في الدقيقة ، تظهر أجسام الأجنة التمثيلية لليوم الخامس واليوم التاسع واليوم الرابع عشر. قم بتغيير الوسيط بعناية كل يومين ، واستبدل كل 15 ملليلترا بتمايز عشوائي جديد. متوسط. لتقييم تأثير الدواء على التمايز ، ابدأ في إضافة الدواء إلى الوسط في اليوم الخامس لمدة 10 أيام كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

باستخدام ماصة معقمة ، اجمع أجسام الأجنة من الصفائح التي يبلغ طولها 10 سنتيمترات في أنبوب صقر سعة 15 مل. دعهم يستقرون لمدة دقيقتين ، ثم استنشق المادة الطافية. اغسلها بخمسة ملليلتر من PBS وانقلها إلى أنبوب خال من نوكلياز 1.5 مل.

اسمح لهم بالاستقرار والاستنشاق رفع snat. أجسام الجنين في مليلتر واحد من كاشف الثلاث وتمرير محلول من خلال إبرة قياس 24 مع حقنة مليلتر واحد تقريبا 15 مرة لتعطيل الخلايا. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل عينة.

دوامة المحتويات لفترة وجيزة ، ثم الطرد المركزي للعينات عند 12 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، اجمع المادة الطافية في أنابيب 1.5 مليلتر دون إزعاج أي من الطبقات الأخرى. ثم أضف كمية متساوية من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪ إلى المادة الطافية واخلط المحتويات برفق عن طريق الرج. انقل 700 ميكرولتر من الخليط إلى عمود دوران صغير واتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية الحمض النووي الريبي في خطوة الشطف النهائية.

ضع 22 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز على عمود الدوران وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 12،000 جم لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بإزالة أنبوب التجميع وضع الحمض النووي الريبي على الجليد. أضف ملليلترا واحدا من مساحة القرص الدافئ لكل قارورة T 25 ملتقية من H تسع خلايا ، واحتضن القارورة لمدة تسع دقائق عند 37 درجة مئوية.

ثم أضف ملليلترين من التدفئة. اغسل الوسط إلى الخلايا المعالجة النازحة وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل خمس مرات باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر. انقل محلول الخلية إلى أنبوب الصقر.

بعد ذلك ، اغسل القارورة بتسعة ملليلتر من وسط الغسيل وأضفها إلى الأنبوب مع الخلايا. PT حصاد خلاياه لمدة ثلاث دقائق ونصف عند 500 G.ثم قم بإزالة snat وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسط الغسيل. قم بعمل PT للخلايا مرة أخرى لمدة ثلاث دقائق ونصف عند 500 جم ثم قم بإزالة sup natant وإعادة تعليق الخلايا في أربعة ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، وأضف 0.5 مل من تعليق الخلية و 4.5 مل من الوسط الطازج في قارورة T 25 المغسولة PBS الجديدة التي تحتوي على الخلايا الليفية الجنينية للفأر المعطلة انقساميا.

قم بتغيير الوسط في القارورة كل يوم. قم بتغطية طبق 10 سم بنسبة 0.1٪ جيلاتين في PBS واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم حصاد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن طريق إزالة الوسط وإضافة مليلتر واحد من acuta إلى قارورة T 25 أثناء انفصال الخلايا.

أضف 6.6 مل من الوسائط الباردة إلى 330 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي المجمدة. قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر واستخدم ملليلترا واحدا من المحلول المصفى لتغطية كل بئر من ستة آبار. سيتم طلاء الخلايا لاحقا على الصفائح المطلية بعد حضانة الخلايا الجنينية البشرية لمدة 30 دقيقة باستخدام Accutane ، وإيقاف التفاعل بإضافة 1.5 مل من وسط Hess.

اكشط الخلايا من القارورة ثم أضف ثمانية ملليلتر إضافية من وسط هيس. قم بإنتاج محلول خلية واحدة عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام خلايا مرشح ماصة سعة 10 مليلتر من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة ثلاث دقائق عند 500 جم ، قم بإزالة المادة الطافية S وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من خلايا الدوران المتوسطة مرة أخرى لمدة ثلاث دقائق عند 500 جم ، ثم قم بإزالة المادة الطافية والريوس. الخلايا في 10 ملليلتر من وسط Hess S الذي يحتوي على مثبط الصخور Y 2 7 6 3 2 بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومولار.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية من صفيحة الأطباق المطلية بالجيلاتين ، وتعليق الخلية على الطبق المطلي بالجيلاتين واحتضانها لمدة ساعة واحدة بالضبط عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الخطوات ، سوف يستقر البلاست الخفيف على الصفائح المطلية بالجيلاتين حيث ستبقى الخلايا الجذعية الجنينية البشرية حرة. يعد وقت الطفو أمرا بالغ الأهمية لأن الحضانة الطويلة ستؤدي إلى تكتل الخلايا الجذعية والحضانة القصيرة لن تزيل سوى عدد قليل من هذه الخلايا الليفية عندما تلتصق الخلايا الليفية.

استخدم الوسط الموجود في الطبق لغسل الخلايا الجذعية غير الملتصقة برفق من اللوحة. اغسل اللوحة مرة ثانية ب 10 ملليلتر من وسط Hess وقم بتجميع الخلايا ، وقم بالطرد المركزي للخلايا لمدة ثلاث دقائق عند 500 جم ، وقم بإزالة المادة الطافية S الناتجة وأعد تعليق الخلايا في ما يقرب من أربعة ملليلتر من الوسط المكيف الذي يحتوي على 10 ميكرومولار من مثبطات الصخور Y 2 و 7 و 6 و 3 و 2 و 10 نانوغرام لكل مليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية الثانية. بعد ذلك ، قم بخلط الخلايا مع تريان الأزرق وعدها في لوحة مقياس الخلوي الدموي.

18 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع على اللوحة قبل الطابق السفلي. تغطي الألواح المطلية بالغشاء الخلايا ب 1.5 مل من الوسط لكل بئر وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة ، قم بتحديث الوسط بعد 24 ساعة أخرى ، قم بتغيير الوسط المتوسط إلى الوسط المكيف الطازج المكمل ب 10 نانوغرام فقط لكل ملليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية 2 72 ساعة.

بعد بذر الخلايا ، قم بتغيير الوسط إلى وسط استبدال المصل بالضربة القاضية. يشار إلى هذه النقطة الزمنية باسم اليوم صفر للتمايز. قم بتحديث الخلايا بوسط جديد كل يوم خلال الأيام الثلاثة القادمة.

عند تغيير الوسائط في اليومين الرابع والخامس ، أضف 25٪ N اثنين من المتوسط المكملات و 75٪ بديلة المصل بالضربة القاضية. متوسط في اليوم السادس حصاد الخلايا لتحليلها. يمكن استخدام أجسام الأجنة في العديد من الدراسات المختلفة.

فيما يلي مثال على دراسة السمية الخلوية التي توضح تأثير تركيزات متفاوتة من ميثيل الزئبق على بقاء الخلايا. من هذا الرسم البياني ، تم تحديد أن النقطة 24 ميكرومولار تسببت في موت الخلايا بنسبة 10٪ وتركيز 1.61 ميكرومولار تسبب في موت الخلايا بنسبة 50٪ بعد التعرض لمدة 14 يوما. تم تشغيل الحمض النووي الريبي المعزول من أجسام الأجنة لثلاث مجموعات معالجة ميثيل الزئبق على مصفوفة دقيقة للنظر في مجموعة متنوعة من المؤشرات الحيوية.

تظهر تلك المعرضة للنقطة 25 ميكرومولار زئبق باللون الأحمر. يظهر أولئك الذين يتعرضون لواحد ميكرومولار ميثيل الزئبق باللون الأزرق ، ويظهر الحمض النووي الريبي الضابط باللون الأخضر. تظهر خريطة تحليل المكونات الأساسية هذه أن الخصائص الوراثية لكل مجموعة معالجة تختلف اختلافا كبيرا عن الأخرى في المجموع تم تعديل أكثر من 276 جينا أكثر من ضعفين عند تعرضها لتركيز ميكرومولار واحد من ميثيل الزئبق.

تم تعديل 30 من هذه الجينات أيضا بواسطة مجموعة التركيز المنخفضة عند النقطة 25 ميكرومولار. في هذه الخريطة الحرارية ، يمكن للمرء أن يرى أن 233 من الجينات المعدلة في مجموعة المعالجة الميكرومولار الواحدة كانت جينات تم تنظيمها بشكل أقل وتم تنظيم 43 منها فقط عن طريق العلاج. لا تنس أن العمل مع النمل التريازولي أو النمل يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما مراعاة الاحتياطات مثل ارتداء نظارات septi وقفازات اليد المقاومة للمواد الكيميائية وأداء جميع الأعمال المتعلقة بالثلاثي في غطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التلوين وتشكيل الحديد ، والتي قد تمزج بين تكوين الأنبوب الخاص بك من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التثبيت الظاهري.