تقييم إعداد وRespirometric من الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة العضلية الهيكلية التي تحصل عليها عن طريق الجلد إبرة الخزعة

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص التحكم التنفسي في الميتوكوندريا التي تم عزلها من أنسجة العضلات الهيكلية المأخوذة بالخزعة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الحصول على كمية صغيرة من العضلات عن طريق خزعة بالإبرة عبر الجلد. والخطوة الثانية هي عزل الميتوكوندريا من العضلة المأخوذة بالخزعة عن طريق التجانس.

بعد ذلك، تُغسل الميتوكوندريا المعزولة وتُفصل عن الأجزاء غير الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي وتمرير العينة عبر قطعة شاش. وتتمثل الخطوة النهائية في وضع الميتوكوندريا المعزولة في أطباق لإجراء تحليل قياس التنفس من خلال مقايسات التدفق خارج الخلوي لتصور معدل استهلاك الأكسجين. وفي الختام، يُستخدم محلل التدفق خارج الخلوي Seahorse لفحص التحكم التنفسي في الميتوكوندريا المعزولة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تتطلب كمية محدودة جداً من الأنسجة العضلية تصل إلى 20 milligrams، كما أنها تحد من التباين بين التجارب. هذه السمات تجعل هذه التقنية مناسبة لتطبيقات الأبحاث السريرية. وتكمن أهمية هذه التقنية في تشخيص الخلل الوظيفي الميتوكوندري لدى المرضى.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث تتطلب خزعة العضلات وعزل الميتوكوندريا إجراءات دقيقة يفضل توضيحها بصرياً بدلاً من الاكتفاء بوصفها نصياً. ولإجراء الخزعة موضعياً، يتم حقن 1%lidocaine، مع الحرص على عدم تغلغل المادة داخل العضلة، ثم الانتظار لمدة 10 دقائق.

للسماح بالتخدير الكافي، يتم أخذ الخزعات من المنطقة الوسطى للعضلة بين نقطتي الاندغام والمنشأ، مع تجنب المناطق تحت اللفافة والمناطق الوترية العضلية. ولتحقيق ذلك، استخدم أولاً إبرة عبر الجلد واتبع صوت فرقعة اللفافة أو مقاومتها كدليل. قم بتقدير العمق باستخدام إبرة التخدير، ثم تحسسه باستخدام شفرة مشرط ضيقة واصنع شقاً بطول أربعة إلى خمسة مليمترات عبر اللفافة.

قم بدفع الإبرة عبر الشق حتى يتم إدخالها في العضلة. اجمع عينات متعددة مع تدوير نافذة الإبرة في اتجاهات مختلفة. طبق شفطاً مستمراً باستخدام حقنة سعة 60 cubic centimeter أثناء دفع وسحب عينات العضلات داخل الإبرة الجلدية من مرتين إلى أربع مرات في اتجاهات مختلفة.

أوقف عملية الشفط وأخرج الإبرة. اطلب من المساعد الضغط بقوة على موقع الوخز لمدة خمس دقائق. ولتحقيق الإرقاء، افصل الإبرة عن أنابيب الشفط وأخرج عينات العضلات بعناية من النافذة والأسطوانة.

قم بإجراء تمريرة ثانية إذا كانت هناك حاجة لمزيد من العضلات عن طريق تكرار هذا الإجراء. قم بإزالة أي جلطات دموية مرئية من عينة العضلات باستخدام الملقط. ثم زن العينة وضعها فوراً في أنبوب يحتوي على ثلج.

قم بتبريد المحلول الملحي الموقوت بالفوسفات (PBS) أو DPBS. قم بإزالة الأنسجة الضامة المرئية من العينة باستخدام مقص حاد وملقط. اغسل العينات جيداً من ثلاث إلى أربع مرات باستخدام محلول DPBS المبرد.

لإزالة الدم، تُحفظ العينات في محلول DPBS مبرد على الثلج وتُعالج في أسرع وقت ممكن. وفي غضون 45 دقيقة من أخذ الخزعة، يجب توخي الحذر لإزالة أي أوتار أو أنسجة دهنية بعناية من عينة العضلة. يتم استئصال جزء صغير من أي أنسجة زائدة لتخزينها في درجة حرارة 80- درجة مئوية.

يمكن استخدام هذه الطريقة لتجارب أخرى مثل لطخة ويسترن (Western blots). قم بتقطيع النسيج العضلي فوراً إلى قطع صغيرة، باستخدام مقص معقم، ثم علّقه في 500 µL إلى 1 mL من مثبط بروتياز Sistine، مثل nagars المذاب في محلول CP one buffer بتركيز 0.2 mg/g من النسيج.

قم بتقطيع العينة حتى تظهر معلقة بشكل جيد. اتبع ذلك بحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل نقلها إلى الثلج، مع التأكد من غسل المجانس جيداً مسبقاً. قم بتجانس الأنسجة المقطعة المعالجة بالناجارات.

باستخدام جهاز تجانس آلي. حافظ على العينة مبردة على الثلج طوال هذه العملية. قم بتجانس كل عينة نسيجية أربع مرات، بحيث تكون كل مرة عبارة عن نبضة مدتها ثانيتان.

باستخدام الموحد الآلي عند ضبط السرعة على 10,000 RPM، ضع العينة مرة أخرى على الثلج. اغسل المسبار بـ 70% ethanol ثم بالماء المقطر بين الأنسجة. الآن، اغسل النسيج الموحد بحجم مساوٍ من محلول chapel Perry one أو محلول CP one buffer.

بعد ذلك، اغسل النسيج بضعف حجم منظم CP two. أضف أنبوب التوازن عن طريق ملء الماء حتى الوصول إلى نفس الحجم في أنبوب مخروطي آخر. اجمع المحتوى في أنبوب طرد مركزي وقم بإجراء الطرد المركزي عند 600 GS في درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. بلل قطعة القماش القطنية مسبقاً للسماح لجميع الجسيمات بالمرور وعدم التصاقها بالقماش.

مرر السائل الطافي عبر قطعة قماش قطنية (cheesecloth) مبللة، مع جمع الراشح والتخلص من الراسب، وذلك لإزالة غالبية الكسور غير الميتوكوندرية. بعد ذلك، قم بإجراء عملية طرد مركزي فائقة للسائل الطافي بسرعة 10,000 GS عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية لمدة 10 دقائق. علّق الراسب في أربعة ملليلتر من منظم CP two قبل إجراء عملية طرد مركزي ثانية بنفس الطريقة المتبعة في عملية الطرد المركزي السابقة.

تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق العجينة في 2 mL من منظم CP one. في هذه المرحلة، ضع كمية صغيرة من هذا المعلق في أنبوب اختبار منفصل لاستخدامها في تقدير البروتين. أعد تعليق العينة المتبقية في منظم CP one ثم قم بالطرد المركزي.

كما سبق، لاحظ وجوب إعداد لوحة البروتين باستخدام المعايير خلال خطوات الطرد المركزي السابقة. وأخيراً، أعد تعليق الراسب النهائي في كمية ضئيلة من محلول مقايسة الميتوكوندريا أو الكتلة. قم بإجراء مقايسات XF لتصور معدل استهلاك الأكسجين أو OCR بوحدة بيكومول من الأكسجين في الدقيقة أو المستويات المطلقة للأكسجين و pH.

في مخرجات البيانات، أضف تركيزاً يعادل 10 أضعاف من المركبات بكتلة X واحدة إلى المنافذ من A إلى D في مقياس التنفس القائم على الأطباق، وذلك للحصول على التركيز النهائي كما هو مدرج في البروتوكول النصي. قم بتحضير حجم كافٍ من المركبات للعدد المطلوب من الآبار.

استخدم حسابات البروتين التي تم قياسها سابقاً لتحديد تركيزات الميتوكوندريا المراد إضافتها. حدد الكمية المثلى من الميتوكوندريا عن طريق معايرة 1 µg و 2.5 µg و 5 µg من الميتوكوندريا لكل بئر في طبق مكون من 24 بئراً لتقليل التباين بين الآبار.

أولاً، يتم تخفيف الميتوكوندريا بتركيز 10x في محلول substrate plus mass بتركيز 1x بارد. بعد ذلك، يتم وضع 50 µL من هذا المعلق في كل بئر. مع ترك أربعة آبار تحتوي فقط على 50 µL من الـ mass لاستخدامها كقراءات خلفية.

ضع لوحة المعايرة التي تم نقعها مسبقاً، بالإضافة إلى الخرطوشة العلوية من الخطوة السابقة، في جهاز قياس التنفس لإجراء معايرة الجهاز. وللتحضير لتشغيل لوحة الاختبار، قم بتدوير اللوحة في جهاز الطرد المركزي بسرعة 2000 GS لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد عملية الطرد المركزي.

أضف برفق 450 µL من محلول mass, plus succinate and rotten بتركيز 1x إلى كل بئر. افحص الميتوكوندريا تحت المجهر للتأكد من الالتصاق المتجانس بقاع البئر قبل نقل الطبق إلى محلل XF. قم بقياس التنفس الميتوكوندري في الوقت الفعلي باستخدام جهاز قياس التنفس عن طريق برمجته وفقاً لإعدادات جهاز قياس التنفس الموضحة في البروتوكول النصي؛ وتظهر هنا ملفات قياس التنفس النموذجية التي يتم تحفيزها بواسطة المعقد الثاني باستخدام 1 µg و 2.5 µg و 5 µg من الميتوكوندريا كما هو متوقع.

بشكل عام، يزداد معدل استهلاك الأكسجين (OCR) مع زيادة كميات الميتوكوندريا. تبلغ نسبة التحكم التنفسي (RCR) المحسوبة لهذا المقاييس 7.95، مما يشير إلى أن تحضير الميتوكوندريا ذو جودة عالية. ومن أجل مقارنة اتساق النتائج عند تحليل كميات مختلفة من الميتوكوندريا، تم إجراء تحليل التباين (Inova) وحساب مجموع المربعات. يتم عرض مجموع المربعات (SS) للحالة الثانية، والحالة الثالثة، والحالة الثالثة غير المقترنة بـ antimycin A، بالإضافة إلى RCR لقياسات الحالة الثانية والحالة الثالثة بطريقة تحليل التباين أحادي الاتجاه.

كانت قيمة Innova ذات دلالة إحصائية، وكذلك الحال بالنسبة لـ ANTIMYCIN وRCR. ولم يُلاحظ أي فرق معنوي في الحالة الثالثة غير المقترنة بين المجموعات. وتشير هذه النتائج إلى أن استخدام 5 µg من الميتوكوندريا لكل بئر قد أعطى أقل قيمة SS مقارنة بالتراكيز الأخرى.

يعمل هذا المخطط كدليل لتحديد كمية بروتين الميتوكوندريا المتوقعة بناءً على الحجم الأولي لعينة العضلات. وكما هو متوقع، يوجد ارتباط قوي بين كمية العضلات التي تمت معالجتها والمحتوى الإجمالي لبروتين الميتوكوندريا في العينة النهائية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في أقل من ثلاث ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد إجراء خزعة العضلة، من المهم التأكد من عدم تناول المريض لأي من الأسبرين أو الإيبوبروفين أو أي من مضادات الالتهاب غير الستيرويدية الأخرى المتاحة بدون وصفة طبية لمدة ثلاثة أيام تالية، وذلك لضمان التئام الأنسجة التي تم أخذ الخزعة منها بشكل جيد. الأمر التالي هو التأكد من عدم قيامهم بأي نشاط بدني شاق أيضاً خلال اليوم والنصف التاليين، لذا يجب تجنب أي أنشطة تتضمن ارتجاجاً، مثل كرة السلة أو القفز على الترامبولين، بينما يمكنهم ممارسة أنشطتهم المعتادة.

نطلب منهم أيضاً إبقاء المنطقة جافة لمدة 24 ساعة، ولكن يجب أن تكون المرة الأولى التي تتعرض فيها المنطقة للبلل أثناء الاستحمام، وذلك لضمان عدم دخول أي أنواع من البكتيريا التي قد تكون موجودة على الجلد ولم يتم تنظيفها إلى موضع الشق الجراحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم أفضل لكيفية أخذ خزعة من نسيج العضلة الهيكلية الجانبية، وعزل الميتوكوندريا، وقياس التحكم التنفسي.