الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في تحديد بروتينات الغشاء التي يتم التعبير عنها في بكتيريا SIA coli لإجراء التحليلات البنيوية والوظيفية. أولاً، يتم حصاد البكتيريا وتحليلها بواسطة SDS page لتصور بروتينات GFP المطوية بشكل صحيح باستخدام الفلورة الهلامية (Ingel fluorescence). في الخطوة الثانية، يتم زيادة حجم إنتاج بكتيريا e coli التي ثبت تعبيرها عن بروتينات الغشاء المستهدفة، ثم يتم تحضير جزء غشائي كلي من الخلايا بعد تحفيز التعبير البروتيني.

أخيرًا، يتم إذابة كسر الغشاء الكلي في أربعة منظفات مختلفة، ثم يتم تحليل أحادية التشتت لبروتينات GFP المذابة باستخدام المنظفات عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. وفي نهاية المطاف، يمكن مراقبة البروتينات بواسطة الفلورة ورسم مخططات ملفات الشطف لتقييم التجمع وأحادية التشتت وكمية GFP الحر في العينات.

لا يزال إنتاج بروتينات الغشاء المؤتلفة للدراسات البنيوية والوظيفية يمثل تحدياً تقنياً بسبب انخفاض قابليتها للذوبان وعدم استقرارها بمجرد استخلاصها في المنظفات. وقد أظهرت الخبرة أن فحص متغيرات متعددة من بروتينات الغشاء، مثل النظائر من أنواع مختلفة، يمكن أن يحسن معدل نجاح التعبير عن بروتينات الغشاء. ويُستخدم الدمج مع البروتينات الفلورية الخضراء للإبلاغ عن الطي الصحيح.

تستخدم الخطوة الأولى في البروتوكول الخاص بنا القائم على GFP لفحص تعبير بروتينات الغشاء في بكتيريا e coli الفلورة داخل الجل (ingel fluorescence) لنواتج تحلل الخلايا الكاملة باستخدام المنظفات، وذلك لتحديد تركيبات بروتينات الغشاء المخصصة لمزيد من التحليل بناءً على مستوى التعبير في الفحص. بعد ذلك، يتم تقييم سلوك اختيار بروتينات الغشاء والمنظفات المختلفة باستخدام الكشف الفلوري المقترن بكروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي، مما يوفر معلومات حول أحادية التشتت (mono dispersity) لمعقدات البروتين والمنظف. ولتحليل التعبير البكتيري المحفز بواسطة IPTG، ابدأ بنقل 1 mL من بكتيريا e coli المعالجة بـ IPTG في مكررات من مزارع ليلية في قوالب ذات 24 بئراً عميقاً إلى قوالب ذات 96 بئراً عميقاً، ثم أحكم إغلاق القوالب وقم بطرد الخلايا مركزياً لمدة 10 دقائق عند 6,000 ×g في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اقلب الكتلة لصب الوسط مع النقر برفق على منشفة ورقية لتصريف أي سائل متبقٍ. أغلق الطبق مرة أخرى واحفظ الخلايا في درجة حرارة -80 °C بعد مرور 20 دقيقة على الأقل. قم بإذابة الكريات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق الخلايا تماماً في 200 µL من محلول التحلل (lysis buffer).

عالج الخلايا بـ 20 µL من محلول DLPI مع الرج بسرعة 1000 RPM ودرجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف 25 µL من DDM بتركيز 10% إلى كل بئر، واحضن الخلايا لمدة 60 دقيقة أخرى مع الرج. بعد المعالجة بـ DDM، قم بطرد مركزي لكتلة الآبار العميقة، ثم انقل 10 µL من المستخلص المصفى إلى لوحة معايرة دقيقة وأضف 10 µL من محلول تحميل هلام SDS page.

الآن، قم بتحميل الهلام بـ 10 µL من محلول منظم التحلل لكل بئر، وشغّل الهلام بجهد ثابت يتراوح بين 100 إلى 120 فولت في غرفة باردة لمدة تتراوح من ساعتين إلى 2.5 ساعة حتى يصل الحجاب إلى القاع. ضع الهلام على جهاز تصوير مزود بمرشح ضوء أزرق للكشف عن البروتينات الاندماجية من أجل زيادة حجم المزارع الخلوية. بعد تحويل خلايا e coli المختصة، اختر مستعمرة واحدة وضعها في 10 mL من مرق المغذي للنمو طوال الليل عند 37 °C.

في صباح اليوم التالي، يتم تخفيف خمسة مليلترات من المزرعة الليلية في 500 مليلتر من مرق power broth، ويستمر نمو المزارع مع الرج بسرعة 250 RPM ودرجة حرارة 37 درجة مئوية. وعندما تصل قيمة OD عند 595 نانومتر إلى 0.5 تقريبًا، يتم تحفيز التعبير عن طريق إضافة IPTG بتركيز نهائي قدره 1 مليمولار، ثم توضع المزرعة مرة أخرى في الرجاجة طوال الليل، ولكن هذه المرة عند 20 درجة مئوية. وفي صباح اليوم التالي، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتخزين الرواسب عند -80 درجة مئوية.

لتحضير أغشية الخلايا، أعد تعليق الكريات الثالثة في درجة حرارة الغرفة في 5 milliliters من PBS لكل جرام من كريات الخلايا، مع زيادة الحجم حسب الضرورة حتى تقل اللزوجة لتصبح ذات قوام سائل. ثم أضف كلوريد المغنيسيوم بتركيز نهائي قدره 1 millimolar، وDNAs بتركيز نهائي قدره 10 micrograms per milliliter، وقرصًا واحدًا من مثبط البروتياز المعبأ مسبقًا لكل 20 gram من كريات الخلايا إلى الخلايا.

بعد ذلك، قم بتكسير الخلايا باستخدام جهاز تكسير الخلايا المبرد عند ضغط 30 KPSI، ثم قم بترسيب الخلايا غير المكسورة والحطام لمدة 15 دقيقة عند 30,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. انقل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي فائق واجمع جزء الغشاء الكلي عن طريق تدوير الطافي لمدة ساعة واحدة عند 200,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. ثم استخدم مجانس الخلايا لإعادة تعليق راسب الغشاء في 10 milliliters من محلول PBS المبرد بالثلج لإذابة الأغشية لكل منظف سيتم استخدامه.

قم بتوزيع 900 µL من معلق الغشاء في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 mL. ثم أضف 100 µL من كل منظف مُحضّر حديثاً إلى الأنابيب المناسبة سعة 1.5 mL، وحضّن المزيج عند درجة حرارة 4 °C مع الرج الخفيف. بعد مرور ساعة، قم بترسيب المنظف والأجزاء القابلة للذوبان باستخدام جهاز طرد مركزي فائق مخبري، مع التأكد من أن الأنابيب ممتلئة إلى النصف على الأقل، واحتفظ بالرائق لإجراء تحليل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم بالكشف الفلوري أو تحليل FEC.

بعد ذلك، يتم استخدام عمود استبعاد حجمي (size exclusion column) بنطاق تجزيء واسع مع تشغيل منظم تدفق بمعدل 0.3 milliliters per minute. ثم تُحقن 100 microliters من عينة غشاء مُذابة في العمود بنفس معدل التدفق، ويتم مراقبة ملف الشطف (elution profile) باستخدام البصريات الفلورية. وأخيراً، يتم استيراد بيانات حجم الشطف وشدة الفلورة إلى برنامج جداول بيانات للعرض الرسومي، وتحليل مادة الغشاء المُذابة المتبقية عن طريق الفلورة داخل الهلام (in-gel fluorescence).

كما تم توضيحه سابقاً، فإن عائلة البروتينات المذكورة ضرورية لانقسام الخلايا البكتيرية. تُظهر هذه الصور تمثيلاً مرئياً بالتألق الهلامي لـ 24 من أصل 47 من البناءات المذكورة. وتشير كثافة الحزم إلى مستوى التعبير البروتيني.

على سبيل المثال، يظهر البروتين الاندماجي في المسار رقم 4 تعبيراً جيداً في كلا السلالتين. ومع ذلك، تشير الحزم الإضافية ذات الوزن الجزيئي المنخفض إلى أن البروتين قد تحلل جزئياً في العديد من المسارات. توجد حزمة يتوافق حجمها مع GFP وحده.

على سبيل المثال، يتم تكسير G four و H four تمامًا إلى GFP حر في سلالة C 41 DE three P lies S. بينما يوجد بعض البروتين السليم في هذه الرسوم البيانية في LEMO 21 DE three. ويوضح تحليل تركيبين أظهرا أداءً جيدًا في الفرز الأولي عن طريق استبعاد الحجم المكتشف بالفلورسنت كيف يتصرف البروتين بشكل مختلف اعتمادًا على أي من المنظفات الأربعة تم اختبارها.

على سبيل المثال، أعطى هذا البروتين قمة متماثلة فقط مع تجمع ضئيل في Dool Multiside، مما جعله المنظف المفضل لعملية التنقية اللاحقة. في المقابل، أظهر بروتين الاندماج الآخر ملفاً تعريفياً مماثلاً في جميع المنظفات المختبرة. يمكن توسيع هذا البروتوكول بسهولة ليشمل، على سبيل المثال، سلالات مختلفة من e coli نمت في ظروف تعبير مختلفة، ومنظفات إضافية في كل من عمليات الفحص الأولية والثانوية.

وباختصار، فإن الغرض الرئيسي من هذا البروتوكول هو تمكين فحص عدد كبير من بروتينات الغشاء من حيث التعبير والاستخلاص بالمنظفات، وذلك بهدف تحديد المرشحين لإجراء المزيد من التحليلات.