الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في الإشريكية القولونية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد بروتينات الغشاء المعبر عنها في SIA coli للتحليلات الهيكلية والوظيفية. أولا ، يتم حصاد البكتيريا وتكذب وتحليلها بواسطة صفحة SDS لتصور بروتينات GFP المطوية بشكل صحيح بواسطة مضان إنجل. في الخطوة الثانية ، يتم توسيع نطاق إنتاج الإشريكية القولونية المحددة للتعبير عن بروتينات الغشاء ذات الأهمية ويتم تحضير جزء غشائي كلي من الخلايا بعد تحريض تعبير البروتين.

أخيرا ، يتم إذابة جزء الغشاء الكلي في أربعة منظفات مختلفة والتشتت الأحادي للمنظف. قابل للذوبان. يتم تحليل بروتينات GFP عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. في النهاية ، يمكن مراقبة البروتينات عن طريق التألق والملامح الملاحية المرسومة لتقييم التشتت الأحادي للتجميع و GFP الحر في العينات.

لا يزال إنتاج بروتينات الغشاء المؤتلف للدراسات الهيكلية والوظيفية يمثل تحديا تقنيا نظرا لقابليتها المنخفضة للذوبان وترث عدم الاستقرار بمجرد استخراجه في المنظفات. أظهرت التجربة أن فحص متغيرات متعددة من بروتينات الغشاء مثل أخصائيي تقويم العظام من أنواع مختلفة يمكن أن يحسن معدل نجاح التعبير عن البروتين الغشائي الاندماج مع بروتينات الفلورسنت الخضراء المستخدمة للإبلاغ عن الطي الأصيل.

تستخدم الخطوة الأولى في بروتوكولنا القائم على GFP لفحص التعبير عن بروتينات الغشاء والإشريكية القولونية مضان إنجل لمحللات المنظفات من الخلايا الكاملة لتحديد تركيبات بروتين الغشاء لمزيد من التحليل بناء على مستوى التعبير في الشاشة ، ثم يتم تقييم سلوك اختيار بروتينات الغشاء والمنظفات المختلفة باستخدام الكشف عن التألق إلى جانب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يوفر هذا معلومات حول التشتت الأحادي لمجمعات بروتين المنظفات. لتحليل التعبير البكتيري المستحث عن IPTG ، ابدأ بنقل مليلتر واحد من IPTG معالج e coline مكرر من المزرعة الليلية 24 كتلة بئر عميقة إلى 96 كتلة بئر عميقة ، وإغلاق الكتل ثم تدوير الخلايا لمدة 10 دقائق عند 6 ، 000 مرة G في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، اقلب الكتلة لصب الوسائط بالنقر برفق على منشفة ورقية لتصريف أي سائل متبقي. أغلق اللوحة مرة أخرى وقم بتخزين الخلايا عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر بعد 20 دقيقة على الأقل. قم بإذابة الكريات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق الخلايا تماما في 200 ميكرولتر من محلول التحلل.

عالج الخلايا ب 20 ميكرولترا من محلول DLPI يهتز عند 1000 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أضف 25 ميكرولترا من 10٪ دودا متعدد الجوانب إلى كل بئر واحتضان الخلايا لمدة 60 دقيقة أخرى مع الرج. بعد جهاز الطرد المركزي للمعالجة DDM ، يقوم بحظر البئر العميق ثم نقل 10 ميكرولترات من المحللة التي تم تطهيرها إلى لوحة ميكروتيتر وإضافة 10 ميكرولترات من مخزن تخزين هلام صفحة SDS.

الآن قم بتحميل الجل ب 10 ميكرولتر من محلول محلول محللة لكل بئر وقم بتشغيل الجل بجهد ثابت يتراوح بين 100 إلى 120 فولت في غرفة باردة لمدة ساعتين إلى 2.5 ساعة عندما يصل الحجاب الحاجز إلى القاع. ضع الجل على جهاز تصوير باستخدام مرشح الضوء الأزرق للكشف عن بروتينات الاندماج لتوسيع نطاق مزارع الخلايا. بعد تحويل Eloqua من الإشريكية القولونية المختصة ، اختر مستعمرة إلى 10 ملليلتر من مرق الطاقة للنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف خمسة ملليلتر من الثقافة الليلية إلى 500 مل من مرق الطاقة واستمر في زراعة الثقافات مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. عندما يكون OD عند 595 نانومتر حوالي 0.5 ، قم بتحفيز التعبير عن طريق إضافة IPTG إلى تركيز نهائي يبلغ ملليموليا واحدا ، ثم ضع المزرعة مرة أخرى في شاكر بين عشية وضحاها هذه المرة عند 20 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتخزين الكريات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لتحضير أغشية الخلايا. أعد تعليق الكريات الثالثة بدرجة حرارة الغرفة في خمسة ملليلتر من PBS لكل جرام من حبيبات الخلية ، مما يزيد الحجم حسب الضرورة حتى تقل اللزوجة إلى تناسق سائل. ثم أضف كلوريد المغنيسيوم إلى التركيز النهائي للحمض النووي المليمولي إلى التركيز النهائي البالغ 10 ميكروغرام لكل مليلتر وقرص مثبط للبروتياز معبأ مسبقا لكل 20 جراما من حبيبات الخلية إلى الخلايا.

بعد ذلك ، قم بفتح الخلايا باستخدام مزيل للخلايا المبردة عند ضغط 30 كيلو بوصة مربعة ثم قم بتكسير الخلايا غير المنقطعة والحطام لمدة 15 دقيقة عند 30،000 مرة جم وأربع درجات مئوية. انقل supinate إلى أنبوب طرد مركزي فائق واجمع الجزء الغشائي الكلي عن طريق تدوير supinate لمدة ساعة واحدة عند 200 ، 000 مرة G وأربع درجات مئوية. ثم استخدم الخالط الخلوي لإعادة تعليق حبيبات الغشاء في 10 ملليلتر من PBS المثلج البارد لإذابة الأغشية لكل منظف سيتم استخدامه.

Aliquot 900 ميكرولتر من تعليق الغشاء في 1.5 ملليلتر بولي أنبوب مركزي. ثم أضف 100 ميكرولتر من كل منظف طازج إلى أنابيب 1.5 ملليلتر المناسبة واحتضان الخلائط عند أربع درجات مئوية مع نباتات معتدلة. بعد ساعة ، قم بتكسير المنظفات والكسور القابلة للذوبان باستخدام جهاز طرد مركزي فائق الطاولة ، مما يضمن أن الأنابيب نصف ممتلئة على الأقل وتحتفظ بعامل الاستلقاء لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم المكتشفة الفلورية أو تحليل FEC.

بعد ذلك ، عمود استبعاد حجم خط الاستواء مع نطاق تجزئة واسع مع مخزن مؤقت للتدفق قيد التشغيل بمعدل 0.3 مل في الدقيقة. ثم قم بحقن 100 ميكرولتر من عينة الغشاء القابلة للذوبان على العمود بنفس معدل التدفق وراقب المظهر الجانبي الفلوري باستخدام بصريات الفلورة. أخيرا ، قم باستيراد بيانات الحجم الإيلوسي وشدة التألق إلى برنامج جدول بيانات للعرض الرسومي وتحليل مادة الغشاء القابلة للذوبان المتبقية عن طريق التألق الداخلي.

كما هو موضح سابقا ، فإن عائلة البروتينات المذكورة ضرورية لانقسام الخلايا البكتيرية. في هذه الصور ، تم عرض ممثل في تصور مضان الهلام ل 24 OUTTA 47 التركيبات. تعطي شدة العصابات مؤشرا على مستوى التعبير.

على سبيل المثال ، يتم التعبير عن بروتين الاندماج في مشهد الممر الرابع بشكل جيد في كلتا السلالتين. ومع ذلك ، تشير نطاقات الوزن الجزيئي الإضافية المنخفضة إلى أن البروتين يتدهور جزئيا في العديد من الممرات. هناك نطاق يتوافق في الحجم مع GFP وحده.

على سبيل المثال ، يتم تقسيم G four و H four بالكامل لتحرير GFP في سلالة C 41 DE three P يكمن S. بينما في LEMO 21 DE الثلاثة ، يوجد بعض البروتين السليم في هذه الرسوم البيانية. يوضح تحليل اثنين من التركيبات التي كان أداؤها جيدا في الشاشة الأولية عن طريق استبعاد الحجم المكتشف من التألق كيف تتصرف البروتينات بشكل مختلف اعتمادا على أي من المنظفات الأربعة التي تم اختبارها.

على سبيل المثال ، أعطى هذا البروتين ذروة متناظرة فقط مع تجميع القمامة في Dool Multiside مما يجعله المنظف المفضل للتنقية اللاحقة. على النقيض من ذلك ، أظهر بروتين الاندماج الآخر مظهرا مشابها في جميع المنظفات التي تم اختبارها. يمكن توسيع هذا البروتوكول بسهولة ليشمل ، على سبيل المثال ، سلالات مختلفة من الإشريكية القولونية التي تزرع في ظل ظروف تعبير مختلفة وموانع إضافية في كل من الشاشات الأولية والثانوية.

باختصار ، الغرض الرئيسي من هذا البروتوكول هو تمكين فحص عدد كبير من بروتينات الغشاء من حيث التعبير والمنظفات من أجل تحديد المرشحين لمزيد من التحليل.