التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم التمايز الحمض النووي الريبي الجزئي ، والتنميط واستهداف Mr.NA التحقق من صحة خط الخلايا الجذعية العصبية البشرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا الجذعية العصبية البشرية أولا على نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد للحث على تمايز الخلايا. الخطوة الثانية هي تحديد التمايز عن طريق قياس نمو عملية المحور العصبي.

بعد ذلك ، يتم تقييم التغييرات في تعبير الحمض النووي الريبي الصغير بواسطة مصفوفة R-N-A-P-C-R. ثم يتم إجراء التحليل الحسابي للحمض النووي الريبي الصغير المعبر عنه تفاضليا لتحديد مجموعة من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف المفترض في النهاية ، يتم التحقق من صحة mRNAs المستهدفة بواسطة بلازميد المراسل ، والتعداء ، ومقايسة لوسيفيراز مزدوجة.

لذا فإن الطريقة التي سيتم تقديمها هنا يمكن أن تساعد في الإجابة على المشكلات الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية العصبية ، مثل توصيف الحمض النووي الريبي الصغير المعبر عنه ، وهي تستهدف الحمض النووي الريبي المرسال في الخلايا الجذعية العصبية البشرية عندما تخضع للتمايز. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا الخلايا الجذعية العصبية. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة الخلايا الجذعية الأخرى مثل الخلايا الجذعية الوسيطة ، أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، أو الأنظمة الأخرى التي تتطلب تحريض التمايز والتوصيف الجزيئي.

يكسر العرض المرئي لهذه الطريقة الخطوات الحاسمة في تمايز خط الخلايا الجذعية للعصبية البشرية والتحقيق في توصيف الحمض النووي الريبي الميكروي والتحقق من صحة الرنا المرسال المستهدف الذي يوضح جزءا من الإجراء سيكون لافانيا ، عالم من مختبري. يجب تنفيذ هذا الإجراء بأكمله في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام تقنيات معقمة. أعد ترطيب السقالات عن طريق الإضافة إلى كل بئر من AL VX 12.

صفيحة بئر ملليلترين من 70٪ من الإيثانول المحضرة باستخدام الماء للري. تجنب لمس السقالات عن طريق توزيع 70٪ من الإيثانول أسفل جدار كل منها. حسنا ، قم بشفط الإيثانول بنسبة 70٪ بعناية واغسل السقالات على الفور بملليلترين لكل بئر من D-M-E-M-F 12 لمدة دقيقة واحدة.

كرر إجراء الغسيل مرتين ، واستنشق بعناية D-M-E-M-F 12 بعد الغسيل النهائي. قم بتغطية السقالات بإضافة ملليلترين من اللامينين في D-M-E-M-F 12 لكل منهما. احتضان اللوحة جيدا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة ساعتين على الأقل.

بعد ذلك ، اغسل الطبق ببذرة D-M-E-M-F 12 الدافئة كل سقالة مع ما يقرب من 500،000 خلية جذعية عصبية بشرية أو H nscs بحجم 150 ميكرولتر من وسط RMM مع عوامل النمو. احتضان اللوحة لمدة ثلاث ساعات للسماح للخلايا بالاستقرار في السقالات بعد ثلاث ساعات. أضف 3.5 مل من RMM إلى كل بئر مع الحرص على عدم إزاحة الخلايا من السقالات.

احتضن الطبق لمدة سبعة أو 21 يوما. استبدل وسط RMM بعد يوم واحد ، وهو التغذية الأولى واستبدل الوسط مرة أخرى بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الرضاعة الأولى. بعد سبعة و 21 يوما من الثقافة ثلاثية الأبعاد ل H nscs.

قم بإزالة وسيط RMM وإصلاح الخلايا المتمايزة باستخدام 4٪ ألدهيد باراشكل. ثم يتم تلطيخ الخلايا الثابتة باستخدام جسم مضاد أولي من بيتا ثلاثة توبولين تم اكتشافه باستخدام فلوروكروم مترافق. نوى خلايا الجسم المضاد الثانوية هي بقع مضادة للخطافات.

التقط صورا تمثيلية لخلايا بيتا الملطخة بالتوبولين الثلاثة. باستخدام مجهر الفلورسنت، احفظ الصور بتنسيق TIFF أو JPEG. يتم قياس نمو عملية المحور العصبي باستخدام أداة قياس الصورة PRO بالإضافة إلى سبعة أدوات قياس برمجية.

للبدء في فتح الصورة ، حدد خيار القياس في شريط الأدوات وحدد ميزة التتبع. لبدء التتبع ، حدد نقطة البداية على نمو المحور العصبي بالنقر فوق تتبع زر الماوس على طول نمو المحور العصبي بالكامل ، انقر بزر الماوس الأيمن لإنهاء كل تتبع. بهذه الطريقة ، قم بقياس جميع نواتج المحور العصبي داخل مجال الرؤية عبر القياسات على شكل بكسل أو ميكرومتر.

تصدير قياسات الطول إلى برنامج جداول بيانات للتحليل المقارن والإحصائي للعينة لتقييم التغيرات في تعبير الحمض النووي الريبي الصغير للمركبات الهيسولوجية الجذعية ثلاثية الأبعاد. قم أولا بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي الصغير وتحضير الحمض النووي الريبي الصغير CD NA كما هو موضح في البروتوكول المصاحب. النص مباشرة بعد الحصول على القرص المضغوط NA الصغير للحمض النووي الريبي.

تحضير خليط مكونات PCR لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في أنبوب سعة 15 مل. أضف 1375 ميكرولترا من مزيج رئيسي أخضر X-S-Y-B-R. 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الصغير CD NA 275 ميكرولتر من التمهيدي العالمي و 1000 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لنقل المياه مجانا.

تختلط مكونات PCR مع خزان تحميل PCR. قم بإزالة مجموعة PCR ذات 96 لوحة بئر بعناية من كيسها المغلق. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 25 ميكرولترا من مكونات PCR.

امزج مع كل بئر من مجموعة PCR. قم بتغيير أطراف الماصة بعد كل خطوة من خطوات سحب العينات لتجنب التلوث المتبادل بين مانع تسرب الآبار. لوحة البئر 96 مع فيلم لاصق بصري وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1000 GS في درجة حرارة الغرفة لإزالة الفقاعات تفحص اللوحة بصريا للتأكد من عدم وجود فقاعات في مكان الآبار.

مجموعة PCR ذات لوحة 96 جيدا في برنامج cycler في الوقت الفعلي. الدراجة في الوقت الحقيقي وفقا لذلك. بعد ذلك ، قم بتصدير قيم التصوير المقطعي المحوسب لجميع الآبار إلى جدول بيانات Excel فارغ لتحليل بيانات مصفوفة PCR ، وهي خوارزمية متاحة عبر الإنترنت يتم استخدام ktar للموافقة المسبقة عن علم لتحديد أهداف الحمض النووي الريبي الصغير المتوقعة.

انقر فوق ، انقر هنا للحصول على صورة التنبؤ بالفقاريات لفتح صفحة جديدة في واجهة الويب PIC KTAR. اختر الأنواع في القائمة المنسدلة وأدخل الحمض النووي الريبي الصغير محل الاهتمام في مربع معرف الحمض النووي الريبي الصغير. انقر فوق البحث عن أهداف الحمض النووي الريبي الصغير.

سيتم تقديم قائمة ب mRNAs المستهدفة المرتبة حسب درجة PIC KTAR. ثم يتم استخدام التصنيفات التي تم الحصول عليها لتجميع جدول مقارن للحمض النووي الريبي الصغير. يتم استخدام بلازميد مراسل لوسيفيراز مزدوج كأداة للتحقق من صحة أنشطة الرنا المرسال المستهدفة ويتم قياس أنشطة اليراع واللوسيفيراز الكلوي بعد 24 ساعة من تعداء خلايا هيلا.

قم بإعداد محلول العمل الأول عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة ، واحد إلى 10 ملليلتر من المحلول واحد والخلط جيدا ، وقم بإزالة وسط نمو الخلية من كل بئر من لوح 24 بئر وإضافة 300 ميكرولتر من محلول العمل واحد إلى كل منهما. انقل جيدا 100 ميكرولتر من محتويات كل بئر. من بين 24 لوحة بئر إلى ثلاثة آبار من صفيحة 96 بئر ، انتظر لمدة 10 دقائق ثم قم بقياس نشاط لوسيفيراز اليراع في مقياس الإضاءة الذي تم تعيينه للحصول على اللمعان.

قم بإعداد محلول العمل الثاني عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة ، واثنين إلى 10 ملليلتر من المحلول الثاني والخلط جيدا. أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل اثنين في كل بئر من لوحة البئر 96 التي تحتوي بالفعل على 100 ميكرولتر من محلول العمل. انتظر المرء لمدة 10 دقائق ثم يقيس نشاط اللوسيفيراز الكلوي.

بعد ذلك ، يتم حساب نسبة اللمعان من لوسيفيراز اليراع إلى لوسيفيراز الكلوي. تم الحصول على صور دقيقة تمثيلية ل H NSCS على سقالات ثلاثية الأبعاد بعد تلطيخ الكيمياء المناعية لبيتا ثلاثة توبولين موضحة باللون الأخضر وصبغة مضادة للنوى مع خطافات موضحة باللون الأزرق ، تم إجراء قياس عمليات المحاور بمساعدة برنامج تحليل الصور. تظهر مقارنة نمو عملية المحور العصبي بين H nscs المزروعة باستخدام سقالات ثلاثية الأبعاد ومع السطح المسطح التقليدي أو الثقافات ثنائية الأبعاد أنه في أسبوع واحد أو ثلاثة أسابيع ، أظهرت الخلايا العصبية المتمايزة ثلاثية الأبعاد نموا أكبر لعملية المحور العصبي.

نتج عن التحليل الحسابي للتنبؤ بالهدف المعلومات المقدمة هنا قائمة بالجينات المستهدفة المتوقعة والدقة والقيم الإجمالية. تم تحديد SOX five و NR four A ثلاثة على أنهما جينات مستهدفة مفترضة. تم استخدام مقايسة مراسل لوسيفيراز مزدوج للتحقق من صحة أهداف microRNAs كما هو موضح هنا.

تم تدمير نشاط لوسيفيراز النسبي من ثلاثة مراسلين رئيسيين من UTR من SOX five و NR four A ثلاثة جينات بشكل كبير في وجود microRNAs المشار إليها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تمييزه في الخلايا الجذعية العصبية والتحقيق في تعبير الحمض النووي الريبي الجزئي والتحقق من صحة الهدف Messenger.RNA.