باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد التغيرات السريعة في التصاق مصفوفة الخلية في الخلايا البطانية المعرضة لعوامل تعديل المصفوفة في الوقت الفعلي باستخدام مقاومة ركيزة الخلية وتصوير الخلايا الحية. في هذه التجربة ، يتم استخدام إنزيم الهيم مايلو بيروكسيداز كعامل تعديل مصفوفة ذات صلة من الناحية الفيزيولوجية المرضية. يتم تحقيق ذلك من خلال طلاء الأسطح أولا بالفبرونيكتين لتوفير ركيزة مصفوفة لاصقة.

ثم يسمح لبيروكسيداز ميو أو MPO بالارتباط بالألياف الفيبرونكتينية. بعد ذلك ، يتم وضع الخلايا البطانية العالقة على الأسطح وتحضنها لتحقيق أقصى ارتباط بالخلايا وتنتشر على الفيبرونكتين. ثم تتعرض الخلايا لبيروكسيد الهيدروجين من أجل بدء أكسدة الفيبرونيكتين بوساطة NPO.

ثم يتم قياس التغيرات السريعة اللاحقة في التصاق مصفوفة الخلية في الوقت الفعلي باستخدام مقاومة ركيزة الخلية وتحليل تصوير الخلايا الحية. تظهر النتائج أن الخسائر السريعة في التصاق مصفوفة الخلايا البطانية الناتجة عن أكسدة الفيبرونيكتين بوساطة NPO يمكن قياسها في الوقت الفعلي بدقة زمنية عالية وبطريقة خالية من الملصقات عن طريق مقاومة ركيزة الخلية وتصوير الخلايا الحية. حسنا ، تتمثل ميزة هذه التقنيات في أنها يمكن أن تحدد التغيرات في التصاق مصفوفة الخلية بشكل مستمر بدقة زمنية عالية ، وهذا يعني أنها يمكن أن توفر رؤى جديدة مهمة حول كيفية قيام تعديلات المصفوفة بإجراء تغييرات في اتجاه مجرى النهر في مورفولوجيا الخلية وعمليات الإشارات المعتمدة على الالتصاق.

البروتوكولات ذات أهمية أوسع من حيث أنه يمكن تكييفها بسهولة عن طريق استبدال MPO بعوامل تعديل المصفوفة الأخرى ، مثل المصفوفة إلى البوابات ، أو البروتياز ، أو باستخدام أنواع الخلايا الملتصقة بخلاف الخلايا البطانية مثل الخلايا الظهارية. للبدء ، أضف 80 ميكرولترا لكل بئر من الفيبرونيكتين لطلاء 96 مصفوفة من الأقطاب الكهربائية الصغيرة المصنوعة من الذهب جيدا لقياسات مقاومة الركيزة الخلية ، أو أضف ملليلترين من الفيبرونيكتين إلى أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي لتحليل تصوير الخلايا الحية. احتضان المصفوفات و / أو أطباق الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

ثم لسد الأسطح ، أضف 0.2٪ BSA واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إضافيتين. بعد ذلك ، أضف البيروكسيديز البشري المنقى في HBSS واحتضنه لمدة 30 دقيقة. ثم استخدم HBSS لغسل الأسطح مرتين لإزالة أي MPO غير مرتبط.

بعد ذلك ، انظر 250 ، 000 خلية لكل ملليلتر من الخلايا البطانية العالقة المعدة وفقا لبروتوكول النص على 96 مصفوفات أقطاب كهربائية صغيرة لمقاومة الركيزة لخلايا البئر مع أسطح مطلية بالفبرونيكتين الأصلية أو MPO. بالنسبة لأطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي مقاس 35 ملم ، أضف ملليلترين من 500 ، 000 خلية لكل مليلتر. مباشرة بعد البذر ، تقوم الخلايا بتركيب ألواح مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة على منفذ حاضنة مقاومة الركيزة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

وخذ قراءات فارغة لبدء الاستحواذ المستمر على بيانات فهرس الخلية. انقل أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي 35 ملم إلى حاضنة 35 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. احتضن لمدة ساعتين للسماح بأقصى ارتباط بالخلية وانتشارها.

بعد الحضانة ، أوقف قراءات مؤشر الخلية مؤقتا وقم بإزالة لوحة مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة لفترة وجيزة أو قم بإزالة الطبق السفلي الزجاجي من الحاضنة ، وشفط snat وأضف HBSS الدافئ لفحص تأثيرات المثبطات أو معدلات MPO أو التفاعلات المحفزة أو مثبطات إشارات الخلية. أضفهم إلى الثقافات. في هذه المرحلة ، ضع لوحة المصفوفة على الفور مرة أخرى في منفذ الحاضنة أو الطبق السفلي الزجاجي في الحاضنة واترك الخلايا بالتوازن لمدة 30 دقيقة.

لبدء أكسدة الفيبرونيكتين المحفز المعتمد على حمض هيبوكلوروس من NPO وإزالة الالتصاق لدراسات مقاومة الخلية ، قم بإزالة لوحة مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة من الحاضنة وإيقاف قياسات مؤشر الخلية مؤقتا. أضف بيروكسيد الهيدروجين إلى HBSS واخلطه برفق عن طريق سحب العينات المتكرر ، وأعد تركيبه على الفور إلى مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة مرة أخرى في منفذ الحاضنة وأعد تشغيل قراءات مؤشر الخلية لدراسات تصوير الخلايا الحية باستخدام أطباق ذات قاع زجاجي 35 ملم. بعد إزالة الطبق من الحاضنة ، يتم تثبيته على مرحلة ساخنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية من مجهر متحد البؤر المقلوب ، ومجهز بعدسة موضوعية مائية 63 ×.

وبصريات DIC لتسجيل أفلام الخلية الحية ، ركز على الخلايا وقم بتحسين بصريات DIC وفقا للإرشادات المشار إليها هنا. ابدأ فيلم DIC وسجل قراءات خط الأساس للخلايا غير المعالجة لمدة دقيقة واحدة ، ثم أضف بيروكسيد الهيدروجين واخلطه برفق عن طريق سحب العينات المتكرر ، وأعد تركيز المجهر واستمر في تسجيل أفلام DIC للخلايا المعالجة للفترة الزمنية المطلوبة. لتحليل بيانات مقاومة ركيزة الخلية ، ابدأ بتصدير البيانات إلى جدول بيانات للتصاق الخلية d.

تعمل الدراسات على تطبيع البيانات عن طريق تحديد القيم المسجلة مباشرة قبل بدء أكسدة الفيبرونيكتين بوساطة NPO إلى بيانات حالية واحدة كمخططات لمؤشر الخلية الطبيعي مقابل الوقت لتحليل بيانات تصوير الخلايا الحية. افتح أفلام تصوير الخلايا الحية DIC المسجلة مباشرة قبل وبعد بدء أكسدة الفيبرونيكتين بوساطة MPO في برنامج تحليل الصور مثل Image J في فيلمين منفصلين على الأقل من أفلام DIC ، وحدد خلايا متعددة بشكل عشوائي وقم بقياس مساحتها المسقطة في إطارات متسلسلة عن طريق تتبع حافة الغشاء يدويا وتحديد عدد وحدات البكسل المغلقة. أخيرا ، قدم البيانات كمؤامرة لمنطقة الخلية الطبيعية مقابل الوقت الذي يؤدي فيه تثبيت معلقات الخلايا البطانية على الفيبرونيكتين أو MPO الحامل للفيبرونيكتين إلى أقصى ارتباط بالخلية وانتشاره في غضون ساعتين كما هو محكوم عليه من خلال استقرار قيم مؤشر الخلية في ركيزة الخلية.

قياسات المعاوقة ، بمجرد إنشاء التصاق الخلوي الأقصى على الفيبرونكتين الأصلي أو الحامل ل NPO ، فإن أكسدة الفيبرونكتين المستهدفة بوساطة حمض هيبوكلوروس المحفز من NPO وتبدأ بإضافة NPOs cos الركيزة بيروكسيد الهيدروجين يسبب انخفاضا سريعا في مساحة سطح ملامسة مصفوفة الخلية المقاسة بمقاومة ركيزة الخلية وتصوير الخلايا الحية كما هو موضح هنا ، الالتصاق الخلوي السريع الظاهر في الخلايا البطانية المرتبطة ب NPO الحامل للفيبرونيكتين استجابة لمعالجة بيروكسيد الهيدروجين غائب في الخلايا المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين وحده. يثبط الميوسين اثنين من الوظيفة الحركية مع BLEs ستاتين يمنع معدل الخلية البطانية de التصاق المقاس بمقاومة ركيزة الخلية, ومن خلال تصوير الخلايا الحية التي تحدد أن التصاق الخلوية والانكماش استجابة لأكسدة المصفوفة تحت الخلوية المحفزة MPO مدفوعة بقوى شد الميوسين ACTO. نظرا لأن هذه الطرق يمكنها قياس التغيرات السريعة جدا في التصاق الخلية بدقة ، فإنها يمكن أن تعطي نظرة ثاقبة للعلاقات السببية بين تغيرات الالتصاق والتغيرات النهائية في عمليات الإشارات المعتمدة على الالتصاق مثل فسفرة SARK أو إشارات الالتصاق البؤري ، والتي يمكن قياسها بسهولة في تجارب متوازية بمرور الوقت باستخدام النشاف الغربي.