تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في خميرة الخباز

الهدف العام للتجربة التالية هو تحديد المتطلبات الجينية بسرعة لتدهور البروتين غير المستقر في Croce Visier. يتم تحقيق ذلك عن طريق دمج إنزيم مراسل مطلوب للنمو في ظل ظروف انتقائية محددة مع بروتين غير مستقر ذي أهمية. بعد ذلك ، يتم زراعة الخلايا البرية أو الطافرة التي تعبر عن بروتين الاندماج على ألواح أجار متوسطة انتقائية.

يوفر اختبار الطلاء مؤشرا مناسبا لاستقرار البروتين على أساس نمو خلايا الخميرة من أجل تأكيد الاختلافات الكيميائية الحيوية في وفرة البروتين بينما يتم تحلل النوع في الخلايا الطافرة التي تؤوي بروتين الاندماج عبر طريقة استخراج البروتين السريعة غير الفعالة لتحليل اللطخة الغربية. تظهر النتائج أن وفرة البروتين غير المستقر تزداد في الخلايا ذات الطفرة في الجين المطلوب للتحلل. العكس صحيح بالنسبة للسلالات البرية المختصة بالتدهور.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل مطاردة النبض وتحليلات مطاردة الدوران هي أنها أقل كثافة في العمالة وتستغرق وقتا طويلا ، مما يسمح بتحديد الإنتاجية السريعة والعالية للمتطلبات الجينية لتدهور البروتين. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمتطلبات التحلل لمجموعة من البروتينات غير المستقرة. يمكن استخدامه أيضا لتحديد منظمي الجوانب الأخرى للتعبيرات الجينية مثل النسخ والترجمة.

سيظهر الإجراءات شيلدون واتس وجوستين كراودر. الطلاب في مختبري قبل الفحص ، يحولون البلازميد الذي يشفر بروتين اندماج يتكون من بروتين غير مستقر وإنزيم مراسل التمثيل الغذائي إلى سلالة خميرة متحولة. يشتبه في وجود عيوب وراثية تتعلق بتنظيم تحلل البروتين كعنصر تحكم ، قم أيضا بتحويل نفس البلازميد إلى سلالة خميرة من النوع البري.

تلقيح المحولات في خمسة ملليلتر من الحد الأدنى من الوسط الذي يختار الخلايا ، ويؤوي جزيئات البلازميد. ضع أنبوب الاختبار في محور دوار مائل واحتضنه طوال الليل عند 30 درجة مئوية في اليوم التالي. قم بقياس الكثافة الضوئية للثقافات الليلية ، ثم معادلة تركيز الخلية لجميع الخلايا عن طريق تخفيف كل مزرعة إلى OD 600 من 0.2 باستخدام وسائط جديدة وأنابيب طرد مركزي فردية معقمة سعة 1.5 ملليلتر.

لبدء الفحص الرئيسي ، قم بإعداد مصفوفة سلسلة تخفيف ستة أضعاف عن طريق نقل 200 ميكرولتر أولا من كل سلالة مخففة مسبقا ، بدءا من OD 600 من 0.2 إلى آبار معينة في العمود الأول من صفيحة بئر معقمة 96 استعدادا للتخفيفات اللاحقة ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 125 ميكرولتر من الماء المعقم إلى الآبار الفارغة في الأعمدة الثانية ، ثلاثة وأربعة. بعد ذلك ، انقل 25 ميكرولترا من الخميرة من العمود الأول إلى العمود الثاني ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط الخلايا بالتساوي والمضي قدما في نقل 25 ميكرولترا من الخلايا من العمود الثاني إلى العمود الثالث. كرر خطوات التخفيف التسلسلي حتى يتم خلط الآبار في العمود الرابع جيدا كأداة مساعدة بصرية لاكتشاف الخلايا.

اطبع قالب شبكي وقم بلصقه داخل غطاء طبق بتري ، بدءا من العمود الأقل تركيزا في مصفوفة التخفيف التسلسلية. انقل أربعة ميكرولترات من الخلايا من كل عمود. على لوحة البئر 96 على لوحة أجار متوسطة الحد الأدنى للتحكم والتي تختار صيانة البلازميد داخل الخلايا ، ضع أربعة ميكرولترات أخرى من الخلايا من كل عمود على لوحة أجار متوسطة منفصلة وبسيطة تختار كلا البلازميد داخل الخلايا.

صيانة والتعبير عن بروتين الاندماج غير المستقر. اترك كلا الطبقين يجف على المقعد لمدة خمس إلى 10 دقائق. أغلق الأغطية ببرام لمنع الجفاف واحتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ستة أيام.

عندما تصبح المستعمرات من الثقافة الأسرع نموا مرئية لأول مرة في أكثر البقعة مخففا على لوحة معينة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وتوثيق مدى النمو. من خلال التقاط الصور الفوتوغرافية ، قد يكون من الضروري التقاط صور للوحات مختلفة في أيام مختلفة أو لنفس اللوحة في عدة أيام. في حالة سلالات الخميرة المختلفة التي تظهر مجموعة واسعة من معدلات النمو ، لذلك تم التأكيد كيميائيا حيويا على أن الجين المحدد في مقايسة النمو ينظم وفرة البروتين يبدأ بتحويل سلالات الخميرة البرية والطافرة مع بلازميد يشفر بروتين الاندماج المذكور أعلاه ، وتلقيح المحولات في خمسة ملليلتر من الحد الأدنى من الوسط الذي يختار صيانة البلازميد داخل الخلايا ويحتضن الأنابيب بين عشية وضحاها في دوار مائل 30 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 من كل ثقافة ليلية. بمجرد أن تصل جميع السلالات إلى OD 600 من 0.4 أو أعلى ، قم بتخفيف جميع الثقافات مرة أخرى إلى 0.2 بوسط جديد بحيث يكون الحجم النهائي لكل سلالة 10 ملليلتر. احتضان الخلايا على شاكر منصة 30 درجة مئوية حتى تصل جميع الثقافات إلى نمو منتصف مرحلة السجل OD 600 ، بين 0.8 و 1.2.

حصاد الخلايا عن طريق نقل 2.5 وحدة OD إجمالية من الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية S. ثم أضف ملليلترا واحدا من دوامة الماء المقطر أو الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الحنك ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر.

عزل الخلايا بالطرد المركزي الثاني لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة snat وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف 100 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.2 مولار إلى معلق الخلية ، وقم بالماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط العينات واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتجنب التحلل الخلوي المبكر. لا تقم بدوامة الخلايا.

اعزل الخلايا مرة أخرى باستخدام جهاز طرد مركزي ثالث لمدة 30 ثانية. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المواد الطافية من الخلايا وقم بتقطيع الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات في 50 إلى 100 ميكرولتر من عينة لامبي واحدة x ، مما يؤدي إلى تغيير طبيعة جميع البروتينات عن طريق احتضان المعلق عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم تبريد الخلية بأكملها على الجليد لمدة خمس دقائق. لفحص وفرة البروتينات المعرضة للتراكم مثل البروتينات التي تحتوي على العديد من أجزاء الغشاء ، حدد تجريبيا الحضانة المثلى لتغيير الطبيعة ودرجة الحرارة والوقت بالبدء من 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بدلا من 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

أخيرا ، اعزل الجزء القابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي للمحللات لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وانقل القطعة إلى أنبوب جديد وتخلص من جزء الحبيبات غير القابل للذوبان. يمكن الآن تحميل الجزء القابل للذوبان مباشرة على صفحة SDS أو هلام أو تخزينه عند سالب 20 درجة مئوية في إعداد مقايسة تحلل البروتين القائم على نمو الخميرة. يتم دمج بروتين الاندماج الثلاثي غير المستقر مع إنزيم استقلابي إضافي يكمل خلفية سلالة الخميرة التي تفتقر إلى نفس الجين الأيضي.

عندما يتم التعبير عن بروتين الاندماج في الخميرة ، يكون عرضة لأحداث نقل قاحلة في غشاء الشبكة الإندوبلازمية. يؤدي هذا الإزاحة الشاذة إلى تدهور البروتين بأكمله بوساطة يوبيكويتين ، بما في ذلك إنزيم التمثيل الغذائي ، وبالتالي منع تكاثر الخلايا. ومع ذلك ، في سلالات الخميرة التي تفتقر إلى يوبيكويتين ليجاز ، يكون بروتين الاندماج محميا من التدهور ، حتى عند متوسط الانتقال الذي يسمح للخلايا بالتكاثر.

لذلك ، في وجود ubiquitin ligase ، هناك تطابق بين تحلل البروتين الذي يحدث داخل الخلايا وفشل خلايا الخميرة في التكاثر على ألواح الأجار المستنفدة المستنقبة. من ناحية أخرى ، في سياق تكاثر خلايا يوبيكويتين ليجاز المعيب أو الغائب يشير إلى أن بروتين الاندماج كان محميا من التدهور لتقليل النمو الأساسي أو الزائف وزيادة صرامة هذا الفحص. يمكن إضافة مثبطات تنافسية للإنزيم الأيضي إلى وسط النمو لتأكيد النتائج التي لوحظت في مقايسة نمو الخميرة.

يمكن أيضا التأكد من الدليل المباشر على تدهور بروتين الاندماج باستخدام لطخة غربية. في حالة وجود أو عدم وجود يوبيكويتين ليجاز ، سوف يتحلل بروتين الاندماج أو يتجنب التدمير على التوالي. من المهم أن تتذكر أن هذه الإجراءات تقدم بشكل مباشر عن وفرة الحالة المستقرة للبروتين المعني.

بعد إجراء هذه الإجراءات ، يمكن إجراء تحليلات مطاردة النبض أو السيكلوهيكسيميد من أجل تحليل حركية تحلل البروتين بشكل مباشر ووجود طفرات وجدت أنها تزيد من مستويات البروتين في حالة الدراسة.