Name: بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من المستخفية المورمة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: اكتشف بروتوكول استنفاد الكولسترول في الخلايا البلعمية لدراسة عدوى Cryptococcus neoformans. تُستخدم تقنية طبقة الكروماتوغرافيا الرقيقة والمجهر الضوئي لتقييم البلعمة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من المنح NIH AI56168، ​​AI71142، AI87541 وAI100631 إلى MDP. ماوريتسيو ديل POETA هو بوروز ويلكوم باحث في مجال الأمراض المعدية.

1. الكولسترول استنفاد الخلايا J774A.1 مع MβCD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 5 J774A.1 الخلايا الشبيهة بلعم لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S). احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من أحادي الطبقة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تم تصفيتها أو تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من حل MβCD في تركيز (10 ملم أو 30 ملم في PBS) أو برنامج تلفزيوني 1X على النحو المرغوب فيه السيطرة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C مع اهتزاز. إزالة طاف والاحتياطي في RT للتحليل الكمي مع عدة المتاحة تجاريا باتباع الإجراء على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X أو المصل DMEM مجانا وتواصل مع العدوى أو ليز الخلايا عن طريق pipettiنانوغرام مرتين إلى ثلاث مرات مع H 2 O منزوع الأيونات لتحليل مع طبقة رقيقة اللوني أو مع عدة. ملاحظة: بعد نضوب الكولسترول والمتاحة تجاريا عدة الكولسترول الكمي يمكن استخدامها. انظر القسم المواد للحصول على التفاصيل. اتبع تعليمات الشركة الصانعة كما هو مكتوب. </li></ol> 2. مراقبة من الكولسترول المحتوى من قبل اللوني طبقة رقيقة (TLC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خزان TLC مرتين مع الأسيتون ومرة ​​واحدة مع محلول الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم). تشبع الخزان مع الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم) حل وترك O / N. ملاحظة: يجب دائما العضوية المذيبات أن تستخدم تحت غطاء الدخان لمنع استنشاق بخار. يجب ارتداء القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات. حمض الخليك هو حمض قوي وينبغي أن تستخدم بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 6 J774A.1 مثل بلعم الخلايا لكل بئر على م 6-جيدالوحة الثقافة ليرة لبنانية في حجم 5 مل من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4، استبدال 1 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من التربسين-EDTA إلى كل بئر، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية، وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب microfuge وإضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ج وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S إلى الخلية بيليه و resuspend بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا والعد الخلايا على عدادة الكريات. تطبيع تركيزات خلية من كل عينة وإضافة عدد متساو من الخلايا لأنابيب زجاجية. ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن للمرءاختيار الجمع بين الخلايا من مجموعات العلاج نفسه للحصول على أكثر تركيزا النهائي استخراج الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من الميثانول ودوامة. ثم، إضافة 1 مل من الكلوروفورم ودوامة. التحقق من حالة المرحلة للتأكد من الحل في الطور. ملاحظة: أنابيب يمكن تخزينها في 4 درجات CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة في RT ونقل طاف لأنبوب جديد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل إضافية من كلوروفورم تليها 1 مل من درهم 2 O. دوامة مرتين لمدة 30 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن أنبوب زجاجي على ميزان حساس واستخدام ماصة باستير الزجاج لنقل المرحلة الدنيا في أنبوب زجاجي من الوزن المعروفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف أسفل الدهون في المبخر الطرد المركزي حتى تجف (حوالي 2 ساعة). تزن أنبوب مع الدهون المجففة وحساب الوزن الدهون الجاف. ملاحظة: الدهون الجافة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لأداء TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الدهون المجففة في الكلوروفورم يكفي لتطبيع تركيز الدهون (عادة 20-50 ميكرولتر) وتحميل 20 ميكرولتر من الدهون المخففة على TLC لوحة السيليكا. تحميل 20 ميكروغرام من الكولسترول مخففة في 20 ميكرولتر من كلوروفورم كمعيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المجففة لوحة TLC إلى خزان TLC المشبعة والسماح مذيب للهجرة يصل إلى 1 سم قبل وحة الحافة. إزالة TLC لوحة من دبابات واتركه حتى يجف حوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الدهون عن طريق وضع في خزان بخار اليود للتحقق الهجرة. إزالة البقع والسماح لتتلاشى لحوالي 10 - 15 دقيقة تحت غطاء محرك السيارة. ملاحظة: اليود هو خطر استنشاق. استخدام دائما تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل لتلطيخ محايد الدهون عن طريق الجمع بين 60 مل من الميثانول مع 60 مل من H 2 O منزوع الأيونات، 4 مل من حمض الكبريتيك، و 630 ملغ من كلوريد المنغنيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية وببطء تراجع لوحة TLC في حل الدهون تلطيخ محايد في علبة وازالة دون النزع قبالة السيليكا لآير. ملاحظة: الحل الدهون تلطيخ محايد يمكن إعادة استخدامها عدة مرات وبحيث يمكن استرجاعها من علبة وضعها مرة أخرى في زجاجة لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح لوحة لتجف تحت غطاء محرك السيارة في RT حتى اختفت جميع فقاعات. تسخين لوحة TLC على مجموعة كتلة الحرارة إلى 160 درجة مئوية، وشار إلى اللون المطلوب. ملاحظة: برنامج قياس كثافة مثل LS الرؤية الأشغال يمكن استخدامها لقياس العصابات المتفحمة لمقارنة عينات الدهون. </li></ol> 3. إصابة الضامة مع C. الأدعومية (H99) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 خلايا تشبه البلاعم 5 لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 5٪ CO 2 O / N. ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم العدوى في الزجاج القاع أطباق مبائر لتسهيل التصوير. لا تزال جميع المبالغ نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة C. الأدعومية (H99)، فحقن 10 مل من YNB مع مستعمرة واحدة تم الحصول عليها من لوحة ضرب واحتضان أنه O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل والاعتماد C. الأدعومية (H99) الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي C. الأدعومية O / N الثقافة في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام وتجاهل. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني ويغسل مع 5 مل من تصفيتها برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS و resuspend في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التخفيف المتسلسل في برنامج تلفزيوني للحصول على 1: 500 التخفيف من ثقافة غسلها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العينة الأصلية إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول 1:10 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر 1:10 عينة المخفف إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 100 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 1: عينة المخفف 100 إلى 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 500 dilutiفي </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 ميكرولتر من 1: 500 التخفيف والاعتماد على عدادة الكريات لحساب عدد من الخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل يعملون لتفعيل الضامة وopsonizing C. الأدعومية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع LPS وIFNγ 100X من الحلول الأسهم من خلال إضافة 10 ميكرولتر إلى 990 ميكرولتر. وتستخدم LPS وIFNγ لتعزيز امتصاص أكلة ولكن ليست مطلوبة لالبلعمة: ملاحظة. إذا كان هناك مصلحة في النشاط فطريات الضامة، نفذ تفعيل O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قبل الإصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في عينة الجمع بين 7.5 ميكرولتر من LPS المخفف، 1.25 ميكرولتر من المخفف IFNγ، 1.25 ميكرولتر من GXM الأجسام المضادة وحجم C. ثقافة الأدعومية الذي يعطي 1.25 × 10 5 الخلايا. جعل حجم ما يصل الى 250 ميكرولتر مضروبا عدد العينات مع DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة واحتضان الحل لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز. ملاحظة:نضوب الكولسترول (الخطوات 1،2-1،4) يمكن أن يتم بالتزامن مع خطوة طهاية. تأكد لعلاج الضامة قبل الجمع بين حل العاملة، حيث أن خلايا opsonized يجب أن تستخدم على النحو الأمثل لم يعد من 20 دقيقة بعد الحضانة خطوة 3.4.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة الضامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضامة غسل مرتين مع المصل DMEM الحرة وإضافة 200 ميكرولتر من opsonized C. حل الأدعومية العمل على كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإصلاح وصمة عار الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا 2 مرات مع DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف أحادي الطبقة خلية لمدة 10 دقيقة وإضافة 200 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة لإصلاح الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة في RT وإزالة أي الميثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 10X بالغيمزا واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 2-3 مرات مع الماء منزوع الأيونات وO جاف / N مع غطاء قبالة. ملاحظة: التصوير يمكن القيام به في اليوم التالي أو ما يصل إلى followi الأسبوعنانوغرام تلطيخ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور وعدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر، عد 300 خلية لكل نقطة بيانات (إذا كان هناك 2 من نفس المعاملة العد 150 لكل بئر) ولاحظ عدد من الضامة المصابة وعدد الخلايا المستخفية اجتاحت. ملاحظة: لضمان حتى أخذ العينات في استخدام نقطة بيانات لوحات 2 في حالة، واختيار 3 مناطق غير متداخلة في لوحة وتعول 50 خلية في المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب مؤشر أكلة بضرب النسبة المئوية للالضامة المصابة حسب متوسط ​​عدد C. الأدعومية في البلاعم. تطبيع مؤشر أكلة بالإعراب عن القيم كنسبة مئوية من برنامج تلفزيوني 1X تعامل السيطرة. بعد عدة محاكمات حساب القيمة المتوسطة والانحراف المعياري للمتوسط ​​لتحديد الاتجاهات في مؤشر البلعمة. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الميكروسكوب من الخلايا في 1،000X أو 400X التكبير. </li></ol></li></ol> 4. التريبان الأزرق الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة معقمة للسلامة الأحيائية، والبذور 10 6 خلايا تشبه البلاعم لكل بئر على 6 جيدا لوحة الثقافة خلية في حجم 5 مل من Dulbecco والحد الأدنى من المتوسط ​​ضروري (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين . احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4 استبدال 2 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر. ملاحظة: تأكد من تضمين عنصر تحكم تعامل مع برنامج تلفزيوني 1X فضلا عن التحكم التي يتم كشط قبل أي علاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية. نقل إلى أنبوب microfuge وتعليق الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا وصمة عار مع 1 ميكرولتر من 4٪ التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا على عدادة الكريات وحساب الجدوى باستخدام المعادلة التالية:٪ الجدوى = [1 - (خلايا الأزرق / مجموع الخلايا)]س 100. القيم تطبيع إلى عنصر التحكم الذي كان دون علاج. بعد عدة محاكمات حساب قيمة المتوسط ​​والانحراف المعياري لتحديد الاتجاهات في قدرتها على البقاء. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية. </li></ol>

<ol><li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li>
<li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages%3A+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li>
<li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173(2012).</li>
<li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li>
<li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li>
<li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococci+At+The+Brain+Gate%3A+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li>
<li>Chrétien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li>
<li>Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li>
<li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Infection+And+Chemotherapy%3A+Official+Journal+Of+The+Japan+Society+Of+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>García-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+Me+If+You+Can%3A+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+And+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li>
<li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Pathology.+9%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li>
<li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+And+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).</li>
<li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22In+The+Pathogenesis+Of+Immune+Evasion+And+Clinical+Manifestations+Of+Falciparum+Malaria.+Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li>
<li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection%3A+Implications+In+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li>
<li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms%2C+And+Their+Role+In%5BTitle%5D)+AND+%22Alveolar+Macrophage+Infectivity.+Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li>
<li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Cell+And+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li>
<li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+Of+Biochemistry+And+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li>
<li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous%5BTitle%5D)+AND+%22In+Serum+From+HIV%2B+And+HIV-+Individuals.+Clinical+And+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li>
<li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).</li>
<li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

في العمل مع هذا البروتوكول من المهم الحصول على عدد خلايا دقيقة عندما تصفيح خلايا الثدييات وopsonizing C. خلايا الأدعومية. هذا يقلل من التباين بين التجارب ويضمن ودقيقة 1: 1 هدف إلى نسبة المستجيب طوال فترة الدراسة. فمن الأهمية بمكان لتنسيق توقيت استنزاف الكولسترول والإصابة لمنع خلايا الخميرة opsonized أو خلايا البلاعم المعالجة من يستريح في RT بين الإجراءات أيضا. فترات انتظار طويلة يمكن أن يؤدي إلى فقدان الجسم المضاد طهاية أو يستكمل الكوليسترول المنضب قبل أن تبدأ ال...

البلعمة هي العملية التي يتم المنضوية كيانات خارج الخلية من قبل الخلايا المضيفة. بل هو سلاح أساسي في ترسانة النظام المناعي للدفاع ضد مسببات الأمراض، ولكن قد تكون في كثير من الأحيان تخريب العملية التي مسببات الأمراض للسماح لاستيعاب ونشر في جميع أنحاء الجسم 1. وبوساطة البلعمة من قبل العديد من الأحداث يشير إلى أن يؤدي إلى التعلق والغمر عن طريق إعادة ترتيب الهيكل الخلوي الخلية المضيفة. البالعات &quot;الفنية&quot; قادرة على إدراك وربط opsonins على سطح الممرض الغازية للإشارة لمرفق وتشكيل أقدام صفاحية التي تبتلع الممرض وتشكيل يبلوع 2. ومن بين ما يسمى البالعات &#39;المهنية&#39; هم الضامة. الضامة هي خلايا متخصصة للغاية التي تنفذ مهام الحماية التي تشمل السعي إلى القضاء على المرض والعوامل المسببة، وإصلاح الأنسجة التالفة، والتوسط من الالتهاب، ومعظمهذه من خلال عملية البلعمة 1،2. المستخفية المورمة هي الأنواع من الخميرة الممرضة التي تسبب مرض خطير يعرف باسم المستخفيات. يتم استنشاق الجراثيم المستخفية من قبل المضيف ويؤدي الى عدوى رئوية التي عادة ما تكون أعراض. ويعتقد أن التعرض منتشر للغاية. وقد أظهرت عينة من 61 طفلا من الأمراض المعدية للأطفال عيادة في مركز مستشفى برونكس لبنان وجدت أن كل الذين شملهم الاستطلاع كان الأجسام المضادة للglucuronoxylomannan السكاريد بالمستخفيات وغيرها من الدراسات انتشار في كل من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) غير مصاب والبالغين المصابين 3، 4. الضامة السنخية هي الخط الأول للاستجابة للعدوى رئوية واضح في معظم الحالات بنجاح الممرض. ومع ذلك، في الأفراد المناعة (المرضى على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية والإيدز) الخميرة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الضامة. في هذهالحالات، يمكن للالضامة بمثابة محراب للتكرار من مسببات المرض ويمكن أن تسهل نشرها على الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث يصبح المرض قاتلا 5-8. ويعتقد أن الضامة حتى يمكن تقديم الخميرة مباشرة في السحايا، مما يساعد الخميرة لعبور حاجز الدم في الدماغ عن طريق &quot;حصان طروادة&quot; نموذج 3،9 - 11. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم عملية البلعمة والعوامل التي تؤثر عليه، وخاصة في الالتهابات بالمستخفيات. العمل السابق في أنظمة الممرض أخرى تشير إلى الكولسترول والدهون الطوافات التي شكلتها الكولسترول وجود دور هام في البلعمة 12-15. الكولسترول هو النوع الأكثر وفرة الدهون في خلايا الثدييات، وتضم 25 - 50٪ من غشاء الخلية الثدييات 16. وقد وجد أن تلعب دورا في تحوير BIOPخصائص hysical الأغشية عن طريق تغيير صلابة من 17. الكولسترول والإسفنجية تشكل معا microdomains الدهون داخل غشاء المعروفة باسم الطوافات الدهنية. تم العثور على الطوافات الدهنية أن تشارك في تشكيل caveolae، فضلا عن توفير مجال معزولة لأنواع معينة من إشارات 16-18. نظرا لصغر حجمها، فمن الصعب لدراسة الطوافات الدهنية في الجسم الحي. طريقة واحدة مفيدة لدراسة دور الطوافات الدهنية هو تغيير ناخبيهم. الميثيل-β-سيكلودكسترين (MβCD) هو مركب التي تم العثور عليها في استنزاف الكولسترول من الأغشية الثدييات ويستخدم عادة لدراسة دور الطوافات الدهنية 18. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة لاستنزاف الكولسترول من أغشية الخلية المضيفة وقياس تأثير استنزاف على قدرة الخلايا المضيفة في phagocytose C. الأدعومية في المختبر. هذا الإجراء يجعل من استخدام زراعة الخلايا TECHNIQUES على البلاعم خلد مثل خط الخلية (J774A.1) كنموذج للعدوى. تم انجازه استنزاف الكولسترول عن التعرض لMβCD، والذي له نواة مسعور محدد لحجم الجامدة وغير قادرة على بمثابة بالوعة للالكولسترول لاستدراجه للخروج من غشاء 19. وقد تم قياس نضوب الكولسترول كميا باستخدام عدة المتاحة تجاريا ونوعيا باستخدام بلي-داير استخراج الدهن تعديل تليها طبقة رقيقة اللوني (TLC) 20. . تم قياس البلعمة عن طريق إصابة خط الخلية مع ثقافة الخميرة opsonized مختلطة مع كوكتيل من انترفيرون γ وlipopolysaccharide في تفعيل الضامة وopsonized المستخفية باستخدام glucuronoxylomannan (GXM) الأجسام المضادة 21-23. تلطيخ والتجارب المجهري سمحت لرؤية الخلايا وحساب مؤشر أكلة لتقييم درجة البلعمة. أخذت معا، وهذا البروتوكول دescribes طريقة الأساسي الذي يدمج تغيير تركيبة الدهون مع عملية الفسيولوجية.

<table><tbody><tr><td>خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية من النوع A2</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 خط الخلية</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>يصل مجمدا. انظر تعليمات ATCC للثقافة.</td></tr><tr><td>دولبيكو s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 & deg; درجة مئوية ودافئة إلى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام</td></tr> HI <tr><td>Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>يحفظ مجمدا عند -20 درجة ؛ C والذوبان قبل إضافته إلى DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U / ml)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>تستخدم لاستيعاب</td></tr><tr><td>حاضنة ثقافة الخلايا DMEM Isotemp</td><td>فيشر النموذج العلمي</td><td></td><td># 3530</td></tr><tr><td>طبق ثقافة 96 جيدا</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x فوسفات مخزن محلول ملحي</td><td>فيشر الكواشف الحيوية العلمية</td><td>BP3994</td><td>خفف إلى 1x وقم بالفلتر أو الأوتوكلاف قبل الاستخدام.</td></tr><tr><td>ميثيل بيتا سيكلودكسترين</td><td>سيجما لايف ساينس</td><td>C4555-10G</td><td>تذوب في 1x PBS لعمل محاليل بتركيزات 10 ملي مولار و 30 ملي مولار شاكر</td></tr><tr><td>مداري</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex لفحص الكوليسترول الأحمر مجموعة</td><td>تقنيات الحياة المجسات الجزيئية</td><td>A12216</td><td>جميع الكواشف لفحص الكوليسترول موجودة داخل المجموعة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay Plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax قارئ الصفيحة الدقيقة</td><td>الأجهزة الجزيئية</td><td></td><td>نموذج F5</td></tr><tr><td>TLC غرفة</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC ورقة</td><td>واتمان</td><td>3030917</td><td>قم بتقليل الحجم المطلوب لغطاء</td></tr><tr><td></td><td></td><td>الدخان</td> لخزان TLC <td>أي غطاء دخان يتوافق مع معايير AIHA / ANSI</td></tr><tr><td>6-Well لوحة</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>مكشطة الخلية</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الدم</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>بيكمان كولتر</td><td></td><td>موديل أليجرا x-30R</td></tr><tr><td>خلاط Votex</td><td>فيشر Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures وصولا إلى 0.1 مجم</td></tr><tr><td>ماصة زجاجية باستور</td><td>فيشربراند</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>كوليسترول</td><td>أفانتي القطبية الدهون</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>مكثف SpeedVac</td><td>النموذج العلمي</td><td></td><td>الحراري # SPD2010</td></tr><tr><td>الأثير البترولي</td><td>فيشر Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل الأثير</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>حمض الخليك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC هلام السيليكا 60 مع منطقة التركيز</td><td>الكروماتوغراهي التحليلية ميليبور</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>رقائق اليود</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>حمض الكبريتيك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المنغنيز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>244589</td><td></td></tr> نظام <tr><td>التصوير UVP EC3</td><td>منتجات الأشعة فوق البنفسجية المحدودة.</td><td></td><td>استخدم برنامج Vision Works LS لتحليل قياس الكثافة</td></tr><tr><td>طبق متحد البؤر القاع الزجاجي</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>تم الحصول عليه من المركز الطبي بجامعة ديوك</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>انظر الشركة المصنعة للحصول على تعليمات التحضير. استخدم تركيز جلوكوز 20 جم / لتر.</td></tr><tr><td>عديدات السكاريد الدهنية</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>تذوب في 1x PBS لصنع 1 مجم / مل من المرق. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.</td></tr><tr><td>إنترفيرون جاما</td><td>سيجما</td><td>I4777</td><td>يذوب في 1x PBS لصنع 0.1 مجم / مل محلول</td></tr><tr><td>مخزون Glucuronoxylomannan الأجسام المضادة (مضاد ل GXM)</td><td></td><td></td><td>هدية من تركيز مختبر Arturo Casadevall هو 1.98 مجم / مل</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>قم بإذابة 0.8 جم من Giemsa في 25 مل من الجلسرين وتسخينها إلى 60 درجة ؛ ج لمدة 1 ساعة. أضف 25 مل من الميثانول إلى المحلول واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة شهر واحد على الأقل.</td></tr><tr><td>مجهر</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 مجهر مع AxioCam MRm لالتقاط الصور</td></tr></tbody></table>

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

المستخفيات هو عدوى تهدد الحياة التي تسببها الفطريات المسببة للأمراض من جنس المستخفية. تحدث العدوى عند استنشاق جراثيم، والتي هي قادرة على تكرار في الرئة العميقة. البلعمة من المستخفية بواسطة الضامة هي واحدة من الطرق أن هذا المرض هو قادرة على الانتشار في النظام العصبي المركزي لتسبب التهاب السحايا والدماغ القاتل. لذلك، ودراسة العلاقة بين المستخفية والضامة مهمة لفهم تطور العدوى. تصف هذه الدراسة بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة البلاعم العدوى التي كتبها C. الأدعومية في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ودرس دور الجامدة المضيف على التفاعلات المضيف الممرض. استخدمت سيكلودكسترين (MCD) في استنزاف الكولسترول من الفئران شبكية ساركوما مثل بلعم خط الخلية J774A.1 - تركيزات مختلفة من الميثيل. وأكد استنزاف الكولسترول وكميا باستخدام كل من المتوفره تجاريامواقع الحكومة الإلكترونية عدة الكولسترول الكمي وطبقة رقيقة اللوني. تم تنشيط خلايا الكوليسترول المنضب باستخدام Lipopolysacharide (LPS) والانترفيرون غاما (IFNγ) وإصابة مع opsonized الأجسام المضادة المستخفية المورمة البرية من نوع الخلايا H99 في نسبة المستجيب إلى الهدف 1: 1. تم رصد الخلايا المصابة بعد 2 ساعة من الحضانة مع C. تم حساب الأدعومية ومؤشر على البلعمة. أدى استنزاف الكولسترول في انخفاض كبير في مؤشر البلعمة. البروتوكولات قدمت وتقدم طريقة مريحة لمحاكاة بدء عملية العدوى في بيئة المختبر ودراسة دور تكوين الدهون المضيف على العدوى.

الكولسترول استنفاد تحليل طاف محفوظة في الخطوة 1.3 من البروتوكول باتباع إرشادات الشركة المصنعة في Amplex الأحمر الكولسترول الفحص عدة غلة تركيز مرتفع من الكولسترول في عينة MβCD تعامل على أنها مقارنة بالكنترول برنامج تلفزيوني 1X. اعتمادا على نوع من الخلايا والتركيز MβCD المستخدمة استنزاف الكوليسترول قد تختلف. لJ774 تعامل مع 10 ملي MβCD، لوحظ وجود استنزاف ما يقرب من 50٪. ويمكن حساب استنزاف باستخدام القيم التي تم الحصول ...

في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول لإصابة الضامة ب Cryptococcus neoformans. أيضا ، يتم شرح طريقة استنفاد الستيرول من الضامة. توفر هذه البروتوكولات دليلا لدراسة الالتهابات الفطرية في المختبر وفحص دور الستيرولات في مثل هذه العدوى.

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح دور الكوليسترول في عملية امتصاص الماكروفاج لـ cryptococcus neoformans. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استنفاد الكوليسترول من خط خلايا ماكروفاج فئراني باستخدام مادة methyl beta cyclodextrin. بعد ذلك، يتم تأكيد استنفاد الكوليسترول وقياس كميته باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ومجموعة أدوات (kit) متوفرة تجارياً.ثم يتم تفعيل خلايا *Cryptococcus neoformans* باستخدام أجسام مضادة متخصصة في الجلوكورونان (glucuronan) أو الزيلومانان (xylomannan) أو مكون GXMA في كبسولة الكريبتوكوكوس. وأخيراً، يتم إصابة البلاعم المستنزفة من الكوليسترول بخلايا *Cryptococcus neoformans* الممتزة. وفي النهاية، يُستخدم الفحص المجهري الفلوري والمجهري الضوئي لتصور الخلايا المصابة والسماح بحساب درجة البلعمة.تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تنفيذها باستخدام معدات مخبرية أساسية في وقت قصير نسبياً ومع ذلك يتم الحصول على نتائج كمية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال إمراضيات الفطريات. على سبيل المثال، ما هو دور طعوم الدهون في العائل في عملية التقاط المسببات المرضية الفطرية؟تمتد آثار هذه التقنية نحو علاج أو الحد من عدوى *Occus* لأن عملية الاستيعاب الداخلي داخل الخلايا البلعمية تعد خطوة حاسمة لبدء المسببات الحرجة. وعلى الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن توفر رؤية حول القدرة العدوانية لمسببات الأمراض الفطرية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات أخرى، مثل مسببات الأمراض intracellular الإجبارية. في كابينة سلامة بيولوجية معقمة، يتم استزراع 10^5 من خلايا J 7 74 A الشبيهة بالخلايا البلعمية بمعدل 0.1 خلية لكل بئر في طبق زراعة مكون من 96 بئراً. وفي 200 µL من وسط DMEM المكمل بـ 10% FBS و 1% بنسيلين ستريبتوميسين (PS)، يتم التحضين طوال الليل عند 37 °C و 5% CO2، وفي اليوم التالي.أزل الوسط من الطبقة الخلوية أحادية الطبقة واستخدم محلول PBS المفلتر أو المعقم بجهاز الأوتوكلاف لغسل الخلايا مرتين. أضف 200 µL من محلول ميثيل بيتا سيكلوديكسترين أو embeta CD بالتركيز المطلوب أو XPBS كعينة ضابطة، ثم حضّن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 °C مع الرج. أزل السائل الطافي واحفظه في درجة حرارة الغرفة لإجراء التحليل الكمي باستخدام طقم تحليل متوفر تجارياً.مباشرة بعد هذا الإجراء باستخدام PBS أو DMEM خالي من المصل، اغسل الخلايا من مرتين إلى ثلاث مرات قبل إجراء قياس كمية الكوليسترول أو الانتقال إلى مرحلة العدوى. انتقل إلى خطوة إصابة الخلايا البلعمية المستنزفة من الكوليسترول داخل كابينة سلامة بيولوجية معقمة. ازرع 10⁵ من الخلايا الشبيهة بالبلعميات في كل بئر.قم بالتحضين في طبق يحتوي على 96 بئراً طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وبتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون في آن واحد. قم باستنبات مزرعة من *C. neoformans* H99 عن طريق عزل مستعمرة واحدة من طبق تخطيط، وتلقيح 10 مليلتر من وسط YNB، ثم التحضين طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج في اليوم التالي. قم بطرد مزرعة *C. neoformans* مركزياً عند 1,700 ضعف الجاذبية (G) ودرجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.أزِل الطافي وأضف خمسة ملليلترات من 1x PBS قبل إجراء عملية الطرد المركزي مرة أخرى. بعد ذلك، استخدم 1x PBS المفلتر لغسل الخلايا ثلاث مرات إضافية قبل إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلترات من 1x PBS. تالياً، لتحضير تخفيف تسلسلي للمزرعة المغسولة، أضف 100 ميكرولتر من العينة الأصلية إلى 900 ميكرولتر من 1x PBS.للحصول على تخفيف بنسبة 1 إلى 10، أضف 100 ميكرولتر من العينة المخففة بنسبة 1 إلى 10 إلى 900 ميكرولتر من محلول 1X PBS للحصول على تخفيف بنسبة 1 إلى 100. وأخيرًا، أضف 200 ميكرولتر من العينة المخففة بنسبة 1 إلى 100 إلى 800 ميكرولتر من محلول 1X PBS. وللحصول على تخفيف بنسبة 1 إلى 500، أضف 10 ميكرولتر من التخفيف النهائي إلى مقياس كرات الدم (hemocytometer) وقم بالعد لحساب عدد الخلايا. لتحضير محلول عمل لتنشيط البلاعم (macrophages) وعمل عملية الطهاية (opsonization) لفطر *C. neoformans*، خفف LPS وإنترفيرون غاما (interferon gamma) بمقدار 100 مرة من المحاليل الأصلية عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من كل مركب في 990 ميكرولتر من محلول PBS. لكل عينة، اخلط 7.5 ميكرولتر من LPS و1.25 ميكرولتر من إنترفيرون غاما و1.25 ميكرولتر من الجسم المضاد GXM و1.25 × 10^5.قم بتجهيز خلايا *C. neoformans*، ثم باستخدام وسط DMEM المكمل بـ FBS وPs، ارفع الحجم إلى 250 µL لكل عينة. قم برج المحلول باستخدام جهاز vortex والتحضين لمدة 20 دقيقة عند 37 °C مع الرج قبل إصابة البلاعم. يمكن إجراء عملية استنزاف الكوليسترول بعد استنزاف الكوليسترول. استخدم وسط DMEM الخالي من السيروم لغسلها مرتين قبل إضافة 200 µL من محلول العمل لـ *C. neoformans* المطبقة (Opsonized) إلى كل منها.تُحضن العينات لمدة ساعتين عند 37 °C. بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا وصبغها. بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام DMEM وتجفيف الطبقة أحادية الخلايا في الهواء لمدة 10 دقائق، يُضاف 200 µL من الميثانول المبرد بالثلج للتثبيت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة أي ميثانول متبقٍ.بعد ذلك، أضف 200 µL من 10 x giza واتركه للحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم استخدم الماء منزوع الأيونات للغسل مرتين أو ثلاث مرات، واترك الغطاء مفتوحاً للتجفيف طوال الليل في اليوم التالي أو حتى أسبوع لاحقاً تحت المجهر. قم بعدها بعدّ 300 خلية لكل نقطة بيانات وسجل عدد البلاعم المصابة وعدد خلايا cryptococcus المبتلعة.احسب المؤشر الحمضي لـ PHA بضرب النسبة المئوية للخلايا البلعمية المصابة في متوسط عدد *C. neoformans* لكل خلية بلعمية. قم بتطبيع المؤشر الحمضي لـ F عن طريق التعبير عن القيم كنسبة مئوية من قيمة المجموعة الضابطة المعالجة بـ XPBS. بعد عدة تجارب، احسب القيمة المتوسطة والانحراف المعياري للمتوسط لتحديد الاتجاهات في المؤشر الحمضي لـ F.استخدم اختبار t للطلاب (student's T-test) لتحديد الدلالة الإحصائية كما هو موضح هنا. وكشف تحليل السائل الطافي المحفوظ من الخلايا المعالجة بـ M beta CD عن ارتفاع مستويات الكوليسترول مقارنة بالسائل الطافي المعزول من خلايا التحكم التي عولجت بـ PBS، مما يشير إلى مستوى أعلى من استنفاد الكوليسترول في الخلايا المعالجة بـ M beta CD. ويمكن حساب الاستنفاد باستخدام قيم الكوليسترول التي تم الحصول عليها من السائل الطافي ومحلل الخلايا كما هو موضح هنا لدعم نتائج استنفاد الكوليسترول.يُظهر تحليل ناتجات تحلل الخلايا باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) انخفاضاً ملحوظاً في صبغ الكوليسترول في الخلايا المعالجة بتركيزات متزايدة من M beta CD cytometry. ويُظهر تحليل TLC اتجاهاً مشابهاً للمقايسة الكمية؛ فبعد العدوى، تظل الخلايا ملتصقة وسليمة، كما تظل مورفولوجيا الخلايا دون تغيير في الخلايا المصابة بـ C. neoformans مقارنة بخلايا التحكم غير المعالجة. وتُظهر الصور المجهرية للخلايا المصابة بشكل مثالي بوضوح ابتلاع C. neoformans داخل الخلايا الثديية.يوضح هذا الرسم البياني أنه عند الحساب بناءً على 300 خلية بلعمية لكل مجموعة علاجية، وُجد انخفاض في مؤشر F الحمضي في الخلايا المستنزفة من الكوليسترول. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون خمس ساعات تقريباً، وهذا لا يشمل أوقات التحضين التي يجب أن تتم طوال الليل بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل استخلاص الأغشية المقاومة للمنظفات من الخلايا البلعمية، للإجابة على تساؤلات إضافية، مثل ما إذا كان استنزاف الكوليسترول يقلل من قدرة cryptococcus على الاختراق من خلال التأثير على الدهون المضيفة بعد تطويرها.تعبّد هذه التقنيات الطريق أمام الباحثين في مجال بيولوجيا الغشاء والمناعة لفهم آليات البلعمة من خلال التفاعلات بين الخلايا البلعمية ومسببات الأمراض الفطرية. يجب تذكر أن العمل مع مسببات الأمراض قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء معدات الوقاية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

الضامة تلعب دورا محوريا في التوازن وعلم الأمراض في العديد من الأنسجة. بروتوكول المقدمة هنا يصف أساليب لاستنزاف...

نضوب وإعادة إعماره الضامة في الفئران

في هذا الفيديو ، نوضح فحص السمية الخلوية لتقييم Cryptococcus neoformans ، وهو فطر ممرض ، عدوى في الضامة. يتم تحديد السمية الخلوية عن طريق إطلاق إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات السيتوبلازمية بسبب تحلل البلاعم الناجم عن عدوى Cryptococcus neoformans.

اختبار إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات للكشف عن عدوى المستخفيات الحديثة في البلاعم

يعرض هذا الفيديو طريقة لتقييم تأثير الأسبرين والإيبوبروفين ، عند الحد الأدنى من تركيزاتهما المثبطة ، على البلعمة البلاعمية باستخدام الخلايا الفطرية الملطخة بالصبغة الفلورية الحساسة للأس الهيدروجيني. تمنع الأدوية الأكسدة الحلقية -2 ، مما يقلل من تكوين البروستاجلاندين ويعزز البلعمة الضامة ، كما لوحظ من خلال قياسات التألق للصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني.

تأثير الأسبرين والإيبوبروفين على قدرة البلعمة للبلاعم

وصفنا طرق للفحص المجهري لقطات فيديو حية من...

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

وهناك طريقة لتقييم قدرة معزولة الضامة السنخية الماوس للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة من قبل الرشاشيات المجهري متحد البؤر.

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

نحن تصف كيفية تصور macrophage- C. الأدعومية (CN) التفاعل في الوقت الحقيقي، مع التركيز بوجه خاص على عملية إيماس غير التحللي باستخدام المجهر الضوئي الرقمي. باستخدام هذه التقنية بشكل فردي الضامة المصابة يمكن دراستها للتأكد مختلف جوانب هذه الظاهرة.

تصور الإيماس غير التحللي من الأدعومية المستخفية من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

نقدم هنا بروتوكولا لتحديد البلعمة لجزيئات الفلورسنت عن طريق خط خلية البلاعم الملتصقة باستخدام طريقة الفلورومترية. تسهل هذه الطريقة القياس الكمي عالي الإنتاجية لاستيعاب الجسيمات بالإضافة إلى بلمرة الأكتين الناتجة.

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

يتم تقديم بروتوكول لزراعة الخلايا لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) المتمايز من البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية. يستخدم البروتوكول الحفظ بالتبريد للخلايا الوحيدة إلى جانب تمايزها السائب إلى الضامة. ثم يمكن بعد ذلك زرع البلاعم المحصودة في آبار الاستزراع بكثافات الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب.

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

نصف طريقة لقياس سرعة تحرك البلعمة نحو مركز الخلية في الخلايا الحية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) من النوع 1 أو بدونه ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للقرص الدوار لتحديد الخلايا المصابة بالفلورسنت والفحص المجهري للمجال الساطع للكشف عن البلعمة.

يبلوع الهجرة والسرعة تقاس في لايف الابتدائية الضامة الإنسان المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1

ومن المعروف أن الدهون تلعب دورا هاما في الوظائف الخلوية. هنا، نحن تصف طريقة لتحديد تكوين الدهون العدلات، مع التركيز على مستوى الكوليسترول في الدم، باستخدام كل HPTLC وHPLC للحصول على فهم أفضل للآليات الكامنة وراء العدلات تشكيل فخ خارج الخلية.

طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

يقدم هنا بروتوكول لتحديد وإنتاج صور ديناميكية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لتنظيم البلعمة الضامة (MΦ) من جزيئات الخميرة غير opsonized (zymosan) التي يتم اقترانها بجزيء فلوري حساس ل درجة الحموضة.

تنظيم الخلايا الجذعية Mesenchymal من البلعم البلعمي; الكمية والتصوير

اكتشف بروتوكول استنفاد الكولسترول في الخلايا البلعمية لدراسة عدوى Cryptococcus neoformans. تُستخدم تقنية طبقة الكروماتوغرافيا الرقيقة والمجهر الضوئي لتقييم البلعمة.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من

استكشف المزيد من الفيديوهات