الكمي قداس الطيفية من التنميط Proteomes خلايا السرطان المستمدة من السائل والأورام الصلبة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح ملامح التعبير البروتيني للأورام السائلة والصلبة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إثراء الخلايا السرطانية أولا من عينات الدم أو الأنسجة المشتقة من المريض. في الخطوة الثانية ، يتم عزل البروتينات من الخلايا السرطانية ثم خلطها بمعيار قياس سك خاص بالورم.

في الخطوة الأخيرة ، يتم هضم خليط البروتين. في النهاية ، يتم استخدام قياس الطيف الكتلي لإظهار ملامح تعبير البروتين من الأورام السائلة والصلبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأورام وعلم الأمراض ، مثل كيف يمكن تحديد أهداف الأدوية وآليات مقاومة العلاج؟

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاكتشاف المؤشرات الحيوية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل التحقيق في السرطانات المتنوعة والصلبة والسائلة. سيتم توضيح الإجراء من معهد الدكتور هانيبال بيرجر لعلم الأمراض والدكتور كريستوف لانز من مختبري لتحضير الخلايا السرطانية السائلة للفرز الفلوري عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ابدأ بعلي نقلا عن مليلتر واحد من عينة الخلية البشرية أحادية النواة المعلقة في PBS بالإضافة إلى 2٪ FBS للتحكم السلبي ، ومليلتر واحد لكل صبغة فلورية مستخدمة في البقعة النهائية. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بالأجسام المضادة المناسبة لعزل خلايا سرطان الدم وضوابط التعويض على الجليد.

بعد 30 دقيقة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS بالإضافة إلى 2٪ FCS. ثم أضف بقعة صلاحية الخلية إلى الأنابيب المناسبة وفرز الخلايا وفقا للتخطيط. جمع العينات في IMDM بالإضافة إلى 10٪ FCS لجمع الأورام الصلبة عن طريق التشريح المجهري بالليزر.

أولا ، استخدم ميكروتوم لقطع أقسام بسمك خمسة إلى 10 ميكرومتر من عينات البارافين الثابتة المدمجة. بعد ذلك ، قم بتركيب الأقسام على شرائح غشاء مغطاة بالفيلم وجفف العينات عند 37 درجة مئوية بعد ساعة واحدة. قم بتقسيم الأقسام وإعادة ترطيبها عن طريق حضانات دقيقة واحدة متتالية في الإيثانول المطلق الزيلين ، 70٪ الإيثانول والماء.

ثم وصمة عار الأقسام بالهيماتين لمدة 20 ثانية. اشطفها بماء الصنبور واجمع الخلايا ذات الأهمية باستخدام نظام التشريح الدقيق بالليزر لاستخراج البروتين من الخلايا السرطانية السائلة التي تم فرزها. قم بتدوير العينة ثلاث مرات ، واغسل الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS البارد خلال جهازي الطرد المركزي الثانيين.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا في 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتحلل كل مرة في 10 إلى الخلايا الست. بعد 15 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للمحللات ونقل المحللة الصافية المحتوية على مادة طافية إلى أنبوب تفاعل جديد لاستخراج البروتين من الخلايا السرطانية الصلبة التشريح الدقيقة. احتضان عينة الأنسجة ب 60 ميكرولتر من محلول تحلل الأنسجة عند 72 درجة مئوية.

بعد 15 دقيقة ، اجمع السائل عن طريق الطرد المركزي القصير وانقل المادة الطافية إلى أنبوب تفاعل جديد. ثم صوتنة المحللة على الجليد لمدة ثلاث دقائق ، تليها حضانة مع 15 ميكرولترا الذين لديهم 20٪ كبريتات ESAL الصوديوم عند 99 درجة مئوية في كتلة تسخين مع 600 دورة في الدقيقة من التحريض. بعد ساعة واحدة ، قم بتدوير المحللة وانقل S natin إلى أنبوب جديد.

بعد ذلك ، حدد تركيزات البروتين لمعيار SLAC الخلوي والفائق ، ثم امزج كميات متساوية من قطع الخلايا السرطانية مع معيار SLAC الفائق ، متبوعا بالليثيوم. قم بعمل مخزن كبريتات تحلية عند 25٪ من حجم العينة وعامل الاختزال بنسبة 10٪ من حجم العينة. ثم قم بتسخين المحلول الناتج في كتلة تسخين لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية.

لقياس تركيز البروتين في محللة الورم الصلبة على قارئ الألواح ، امزج سلسلة محلول تخفيف ألبومين مصل الأبقار القياسية ، والمحللة ومعيار SLAC الفائق المناسب مع مقايسة البروتين المتوفرة تجاريا ولوحة 96 بئر. بعد دقيقة واحدة من الاهتزاز ، احتضن العينة للفترة الزمنية المناسبة وقم بقياس الامتصاص كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. ثم امزج كميات متساوية من المحللة المصفاة ومعيار SLAC الفائق مع 200 ميكرولتر من اليوريا في وحدة ترشيح وقم بالطرد المركزي للعينات لمدة 30 دقيقة.

لتحليل تحلل الخلايا السرطانية عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة والتحليل الطيفي الكتلي. ابدأ بحل الببتيدات ذات الأهمية في 30 ميكرولتر من عازلة التحميل لمدة خمس دقائق في حمام صوتنة. ثم قم بتدوير البروتين ونقل المادة الطافية الصافية إلى قارورة أخذ عينات السيارات الطيفية الكتلية.

بعد ذلك ، قم بحقن خمسة ميكرولترات من العينة لكل تحليل في سيارات نظام nano lc و ms MS و أخذ العينات وتركيز الببتيدات وتحلية الببتيدات عبر الإنترنت في إعداد عمود معكوس C 18 مثبتا ومنفوذا. أخيرا ، افصل الببتيدات على عمود دقيق معكوس من المرحلة C 18 في عمود رش نانو ذاتي الخطى. باستخدام تدرج 90 دقيقة من خمسة إلى 35٪ أسيتيل نتريل مقابل 0.1٪ حمض الفورميك المائي عند 300 نانولتر في الدقيقة ، ثم استخدم مصدر أيون رش النانو لنقل الببتيدات وتحليلها.

باستخدام أفضل 15 طريقة للحصول على البيانات ، يمكن استخدام أنواع مختلفة من مطياف الكتلة لتحليل الببتيدات. يعد التنميط البروتيني للأورام السائلة والصلبة من المرضى نهجا واعدا لاكتشاف مؤشرات حيوية تشخيصية وتنبؤية جديدة. على سبيل المثال ، يوضح هذا الشكل الأول استراتيجية بوابة نموذجية لعزل خلايا السرطان من عينة الورم

بينما هنا ، يوجد قسم بسمك خمسة إلى 10 ميكرومتر مثبت على شرائح غشائية مغطاة بالفيلم كما هو موضح للتو. كما هو موضح ، تم اختيار منطقة الاهتمام يدويا واستئصالها عن طريق التشريح الدقيق لالتقاط الليزر ، ويمكن بعد ذلك إجراء التحليل العنقودي غير الخاضع للإشراف لملامح تعبير البروتين لعينات الورم السائلة والصلبة عن طريق قياس الطيف الكتلي ، مما يسمح بالفصل الواضح لكيانات الورم المختلفة وفقا لملامح تعبير البروتين المتميزة. قد تساهم هذه البيانات في النهاية في إنشاء مؤشرات حيوية ذات صلة سريريا.

يمكن أيضا تنفيذ استراتيجيات التخصيب لتعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفرة أو تهوية UIC للإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف يمكن تحديد أنماط كيناز غير المنظمة بعد تطورها؟ تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأمراض والأورام لاستكشاف المؤشرات الحيوية المحددة ومسارات الإشارات في مجموعة متنوعة من الكيانات السرطانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل البروتينات عن السرطانات كمجموعات سكانية فرعية لتحليل أنماط تعبير البروتين وحالات الإشارات عن طريق قياس الطيف الكتلي.