Name: إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: تعلم إصابة الأوعية الدموية ميكانيكياً في أجنة سمك الزرد لدراسة تخثر الدم والالتهابات. تتيح هذه الطريقة رصد شفاء الجروح بالمجهر الزمني في نموذج حي شفاف.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورين ستيفن ويلسون وليزا ويلسباخر على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل HL054737 المعاهد الوطنية للصحة.

وتمت الموافقة على إجراءات باستخدام الزرد التي كتبها المؤسسي رعاية الحيوان UCSF واللجنة الاستخدام: ملاحظة. 1. إعداد أدوات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج التفاصيل التافهة دبوس إلى حامل دبوس المشبك ودبوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غيض غرامة، وثني بعناية غيض من دبوس لخلق هوك طفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتلاعب واستقرار الجنين أثناء الإصابة، ثني نهاية 28 GUAGE ½ بوصة إبرة شنت على حقنة الأنسولين باستخدام كماشة الإبر الأنف. </li></ol> 2. إعداد الزرد الأجنة للإصابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أزواج تربية الزرد وجمع البيض في الماء البيض (60ug / مل الأملاح الحوض) كما هو موضح سابقا (22). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU) إلى الماء البيض عندما الأجنة ما يقرب من 8 ساعات ما بعد الإخصاب (HPF) لمنع التصبغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate اثنين الإخصاب آخر يوم (إدارة الشرطة الاتحادية) الأجنة قبل التجربة باستخدام ملقط غيض غرامة. <br/&gt; ملاحظة: الأجنة يمكن إصابة أي وقت بعد بدء التداول. البيانات المعروضة هنا هي لمدة 2 DPF الأجنة، ولكن تم تطبيق هذه التقنية بنجاح في الأجنة تصل إلى 5 DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة مع 0.02٪ مخزنة حامض 3-أمينوبنزويك (تريكين) حوالي 10 دقيقة قبل التلاعب. </li></ol> 3. السفينة الميكانيكية إصابة الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة تخدير إلى شريحة الاكتئاب على stereomicroscope تشريح باستخدام الماصة نقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الجانب المسطح قصيرة من إبرة حقنة لمعالجة الجنين مع اليد المهيمنة، ضع الجنين على جانبها مع السطح البطني تواجه بعيدا عن إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع دبوس التفاصيل التافهة مع طرف وأشار مباشرة ضد السطح البطني للالخلفي الأسماك لافتتاح البولي التناسلي. وضع دبوس التفاصيل التافهة في زاوية طفيف بحيث غيض المنحني قادر على يخترق من خلال محيط بالأدمة مباشرة في الوريد الذيلية (الشكل 1 &lt;/ قوي&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة حقنة لمعالجة الجنين، يخترق الوريد الذيلية مع دبوس التفاصيل التافهة من خلال الاستفادة من الجنين إلى دبوس لربط قليلا من دبوس في الوريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة حقنة، وسحب الجنين بعيدا عن دبوس التفاصيل التافهة لخلق تمزق صغير في السفينة. ملاحظة: سوف اصابة ناجحة تؤدي إلى نزيف فوري من الوريد. </li></ol> 4. تحليل الإرقاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الأجنة الوحيدة مع تعميم واضح خلايا الدم لهذا الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستعداد لبدء الموقت في أقرب وقت يتم سحبها دبوس التفاصيل التافهة من السفينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء موقت في أقرب وقت فقدان الدم يمكن تصور من الجرح. عندما فقدان الدم من الجرح تتوقف، إيقاف الموقت وتسجيل الوقت الإجمالي كما نزيف الوقت. إذا تخثر هو تحول دون، تسجل الوقت إلى حين لم يعد هناك بشكل واضح خلايا الدم. </li></ol> 5. تحليل التئام الجروح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل نقاط البيعالحيوانات تي إصابة على أطباق التصوير الزجاج السفلي للفحص المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغالبية العظمى من المياه البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الأجنة في 0،3-1،2٪ انصهار منخفضة المنحل الاغاروز في الماء البيض، ساخنة إلى ما بين 42 و 45 درجة مئوية وتستكمل مع 0.02٪ تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الموقف على الجانبين باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يبرد الاغاروز، وملء الطبق مع 0.02٪ تريكين في الماء البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور باستخدام brightfield، epifluorescence، أو المجهري متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجنين من الاغاروز باستخدام ملقط ونقل مرة أخرى إلى المياه البيض. </li></ol>

<ol><li>Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGore%2C+AV+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22">Cold Spring Harb Perspect Med</a>. 2 (5), a006684(2012).</li>
<li>Boatman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+hematopoiesis+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Assaying hematopoiesis using zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).</li>
<li>Ellett, F., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+vertebrate+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+organism+to+study+development+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model organism to study development of the immune system.</a> Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).</li>
<li>Lieschke, G. J., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fish immunology.</a> Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).</li>
<li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>LeBert, D. C., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound repair.</a> Semin Immunol. , (2014).</li>
<li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).</li>
<li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-inflicted+injury+of+zebrafish+embryonic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (71), e4351(2013).</li>
<li>Matrone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+thrombosis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-induced thrombosis in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).</li>
<li>Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+fibrinogen+in+zebrafish+results+in+symptoms+consistent+with+human+hypofibrinogenemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia.</a> PLoS One. 8 (9), e74682(2013).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+zebrafish+antithrombin+III+triggers+disseminated+intravascular+coagulation+and+thrombosis%2C+revealing+insight+into+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemophilia+model+in+zebrafish%3A+analysis+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis.</a> Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+genetic+model+for+hemostasis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis.</a> J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+blood+coagulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Analysis of blood coagulation in the zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev Biol. 7, 48(2007).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).</li>
<li>Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fibrin+formation+and+platelet+and+endothelial+cell+activation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).</li>
<li>Bielczyk-Maczynska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loss+of+function+screen+of+identified+genome-wide+association+study+Loci+reveals+new+genes+controlling+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis.</a> PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

وقد استخدمت بنجاح الزرد كنموذج لأنواع مختلفة من الجروح بما في ذلك الضرر الليزر 13-15، التي يسببها الليزر تخثر 16، والظهارية اصابة 10. نحن التقرير وسيلة لإصابة الميكانيكية التي هي بسيطة لتنفيذ وتنتج الإصابة التي تسيطر عليها في نموذج في الجسم الحي التي هي قابلة للغاية لفي الوقت الحقيقي المجهري. النتائج إصابة في رد مرقئ سريعة وقابلة للقياس وبرنامج إصلاح الجرح استنساخه التي يمكن رصدها باستخدام الفيديو وtimelapse المجهري. <p class="jove_con...

تم استخدام أسماك الزرد على نطاق واسع لدراسة مجموعة متنوعة من الموضوعات في بيولوجيا الأوعية الدموية ، بما في ذلك تطور الأوعية الدموية ، وتكوين الأوعية الدموية ، وتطور المكونة للدم وعلم الأمراض1-3. تطور الأجنة دورة وظيفية بالإضافة إلى الكريات البيض والمكونات الأخرى للجهاز المناعي الفطري بيوم واحد بعد الإخصاب (dpf) 1،4،5. إن الحفاظ على الاستجابة الالتهابية والكريات البيض للإصابة جعل جنين الزرد نموذجا إعلاميا لعمليات التهابية متنوعة مثل عدوى السل والتهاب الأمعاء والقولون وتجديد الأنسجة6-9. تم استخدام أجنة أسماك الزرد لدراسة الالتهاب المرتبط بالإصابة خاصة في سياق الجرح الظهاري واستجابة العدلات10،11. تؤدي إصابة الجنين إلى استجابة خلوية محفوظة للغاية من الخلايا الموجودة في موقع الإصابة والخلايا المناعية الفطرية المجندة للاستجابة للإصابة وتنظيم قرارها11،12. استخدمت نماذج الإصابات الأخرى نبضات الليزر المركزة لتحديد موقع الإصابة مكانيا لأنواع معينة من الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية وخلايا العضلات وخلايا عضلة القلب13-15. 
 تم استخدام أجنة أسماك الزرد كنموذج لدراسة الإرقاء والتخثر في ظروف التلاعب الدوائي والجيني ، باستخدام كل من تكوين الجلطة الميكانيكية والليزر16-19. يبدو أن مكونات سلسلة التخثر محفوظة جيدا وقد سمحت الجينات المعدلة وراثيا بإجراء دراسات مفصلة لترسب الصفيحات والفيبرين في موقع التخثر17،20،21. يكمل الإجراء المقدم في هذه الورقة هذه الأساليب من خلال توفير نظام لدراسة إصابة الأوعية الميكانيكية التي تؤدي إلى اختراق السفينة وتشكيل الجلطة وحلها وإصلاح السفينة.

<table><tbody><tr><td>دبابيس دقيقة</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>26002-10</td><td>قطر الطرف 0.0125 مم ، قطر القضيب 0.1 مم</td></tr><tr><td>حامل الدبوس</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 ملقط طرف ناعم</td><td>أدوات العلوم</td><td>الدقيقة 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>شريحة الاكتئاب الزجاجي</td> الأنظمة <td>البيئية المائية</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>ذوبان منخفض Agarose</td><td>Lonza &nbsp ؛</td><td>50081</td><td>مسخن مسبقا إلى 42 & ordm; C</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>أطباق التصوير ذات القاع الزجاجي</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr> تشريح <tr><td>المجهر</td><td>أوليمبوس</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td>المجهر الفلوري</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>أملاح حوض السمك</td><td>حقنة الأنسولين المحيطية</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الفورية مع إبرة 28.5 جرام</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>329461</td><td></td></tr></tbody></table>

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

أثبتت أجنة Zebrafish (Danio rerio) أنها نموذج قوي لدراسة مجموعة متنوعة من عمليات النمو والمرض. يجعل التطور الخارجي والشفافية البصرية هذه الأجنة قابلة بشكل خاص للفحص المجهري ، وتتوفر العديد من الخطوط المعدلة وراثيا التي تصنف أنواعا معينة من الخلايا ببروتينات الفلورسنت ، مما يجعل جنين الزرد نظاما مثاليا لتصور تفاعل الأوعية الدموية ومكونات الدم وأنواع الخلايا الأخرى أثناء الإصابة والإصلاح في الجسم الحي. تم تطوير علم الوراثة الأمامي والعكسي في أسماك الزرد بشكل جيد ، ويمكن التلاعب الدوائي بذلك. نصف نموذج إصابات الأوعية الدموية الميكانيكية باستخدام تقنيات المعالجة الدقيقة التي تستغل العديد من هذه الميزات لدراسة الاستجابات لإصابة الأوعية الدموية بما في ذلك الإرقاء وإصلاح الأوعية الدموية. باستخدام مزيج من الفحص المجهري بالفيديو والفواصل الزمني ، نوضح أن هذه الطريقة لإصابة الأوعية الدموية تؤدي إلى استجابات قابلة للقياس وقابلة للتكرار أثناء الإرقاء وإصلاح الجروح. توفر هذه الطريقة نظاما لدراسة إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها بالتفصيل في نموذج حيواني كامل.

تم تنفيذ إصابة سفينة الميكانيكية في 2 DPF الأجنة (الشكل 2A - C). النتائج إصابة في استجابة سريعة وموثوق بها تخثر مقاسا الوقت لوقف النزيف (الشكل 2D). لتحديد ما إذا كان الاختلاف في الاستجابة التخثر يمكن قياسها، كانت تدار من هيرودين تخثر إلى الأجنة عن طريق الحقن في القناة كوفييه على الفور قبل اصابة (5-10 NL من 1 وحدة لكل ميكرولتر هيرودين المذاب في الماء) (لل مظاهرة من الحقن في القناة كوفييه، انظر المادة السابقة إن الرب 23) 24.</s...

توضح هذه المقالة طريقة لإحداث إصابة ميكانيكية في الأجنة في أسماك الزرد. يوفر نموذج الإصابة هذا منصة لدراسة الإرقاء والالتهابات المرتبطة بالإصابة والتئام الجروح في كائن حي مناسب بشكل مثالي للفحص المجهري في الوقت الفعلي.

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

الهدف العام من الإجراء التالي هو إحداث إصابة وعائية ميكانيكية في أجنة سمك الزيبروفيش. ويتم تحقيق ذلك عن طريق ثقب الوريد القذالي لجنين سمك الزيبروفيش باستخدام دبوس دقيق. بعد ذلك، يتم تقييم الإرقاء عن طريق قياس المدة الزمنية التي يتدفق فيها الدم بنشاط من الجرح.بعد ذلك، يتم إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني (time lapse microscopy) لتصور جوانب التئام الجروح مثل إصلاح الأوعية الدموية. وتظهر النتائج أن إصابة الأوعية الدموية ميكانيكياً في أجنة zebrafish يمكن استخدامها لقياس جوانب الإرقاء وإصلاح الجروح بشكل قابل للتكرار، مثل أوقات النزيف والوقت الذي يستغرقه استعادة تدفق الدم. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بنماذج الإصابة في الفئران والنماذج القياسية الأخرى في أنه يمكن تصور الالتهاب والإرقاء والإصلاح بسهولة في جنين zebrafish باستخدام الفحص المجهري في الوقت الحقيقي.للبدء، أدخل دبوس دقيق في حامل دبابيس وثبته باستخدام ملقط دقيق. قم بثني طرف الدبوس بعناية لتكوين خطاف صغير للتلاعب بالجنين وتثبيته أثناء إحداث الإصابة. استخدم كماشة مدببة لثني طرف إبرة قياس 28، بطول نصف بوصة، مثبتة على حقنة إنسولين.بعد ذلك، يتم تحضير أجنة أسماك الزيبرفيش عن طريق إعداد أزواج التكاثر وجمع البيض في ماء البيض كما تم توضيحه سابقاً. عندما تصل الأجنة إلى عمر 8 إلى 24 ساعة بعد الإخصاب أو HPF، يُضاف PTU إلى ماء البيض لمنع التصبغ في اليوم الثاني بعد الإخصاب أو DPF. تُستخدم ملقاط دقيق لإزالة غشاء الكوريون من الأجنة، ثم تُخدر الأجنة باستخدام تركيز نهائي قدره 0.02% Buffered trica لإحداث إصابة ميكانيكية في الأوعية الدموية الجنينية.استخدم ماصة نقل لوضع الأجنة المخدرة على شريحة مقعرة. أثناء الاستناد إلى مجهر تشريحي مع إمساك الجانب القصير والمسطح لإبرة حقنة في اليد المهيمنة، قم بوضع الجنين على جانبه بحيث يكون السطح البطني مواجهًا للجهة البعيدة عن الإبرة. الآن، ضع دبوس التثبيت الدقيق بحيث يتجه طرفه مباشرة نحو السطح البطني للسمكة في المنطقة الخلفية لفتحة الجهاز البولي التناسلي.أمسكه بزاوية مائلة قليلاً بحيث تتمكن الطرف المنحنية من اختراق الجلد الخارجي مباشرة وصولاً إلى الوريد السري. ثم استخدم إبرة المحقنة لتحريك الجنين. استخدم دبوس التثبيت الدقيق لثقب الوريد السري عن طريق دفع الجنين برفق نحو الدبوس لتعليق الدبوس قليلاً في الوريد باستخدام إبرة المحقنة.اسحب الجنين بعيداً عن دبوس التثبيت الدقيق لإحداث تمزق صغير في الوعاء الدموي. ستؤدي الإصابة الناجحة إلى نزيف فوري من الوريد. لهذا الإجراء، اختر فقط الأجنة التي تظهر فيها خلايا دم تدور بشكل مرئي.مع وضع دبوس الوخز (minutia pin) في مكانه، اسحبه من الوعاء وبمجرد أن يصبح فقدان الدم مرئياً من الجرح، ابدأ بتشغيل الميقاتية. عندما يتوقف فقدان الدم من الجرح، أوقف الميقاتية وسجل الوقت الإجمالي كزمن النزيف؛ وفي حال تثبيط التجلط، سجل الوقت الذي لا تعود فيه الخلايا الدوارة مرئية. انقل الحيوانات بعد الإصابة إلى أطباق تصوير ذات قاعدة زجاجية للفحص المجهري، وقم بإزالة معظم مياه البيض، ثم غطِّ الأجنة بـ 0.3 إلى 1.2% low melting aeros مدعمة بـ 0.02% trica ومسخنة إلى درجة حرارة تتراوح بين 42 و 45 degrees Celsius.استخدم الملقط لوضع الأجنة على جوانبها. بعد أن يبرد الـ aro، املأ الطبق بـ 0.02%trica في ماء البيض. استخدم مجهر الفلورسنت العاكس ذو المجال المضيء أو المجهر البؤري (confocal) للحصول على الصور بعد التصوير.استخدم الملقط لنقل الأجنة مرة أخرى إلى الماء الخاص بالبيض. يوضح هذا الفيديو إصابة ميكانيكية في الوعاء الدموي تم إجراؤها على جنين 2D PF. يمكن رؤية فقدان الدم النشط يليه توقف النزيف؛ حيث تؤدي الإصابة إلى استجابة تخثر سريعة وموثوقة كما يتم قياسها من خلال الوقت المستغرق حتى توقف النزيف، وذلك لتحديد ما إذا كان من الممكن قياس اختلافات في استجابة التخثر أم لا.تم إعطاء مضاد التخثر odin للأجنة عن طريق الحقن في قناة QVA مباشرة قبل إحداث الجرح. وكما هو موضح هنا، أدى العقار إلى زيادة أوقات النزيف بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة التحكم التي تلقت المذيب فقط. وفي هذا الفيديو، يمكن رؤية أدلة على تلف الأوعية الدموية والتخثر فور حدوث الإصابة باستخدام سلالات متحولة جينياً لعلامات الخلايا البطانية وخلايا الدم الحمراء.تم التقاط الصور كل خمس دقائق لمدة 12 ساعة لإظهار المراحل المختلفة لإصلاح الجرح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إحداث إصابة ميكانيكية في أجنة zebra fish.

mechanical-vessel-injury-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

الأسلوب المعروضة هنا تشمل إصابة الأجنة الزرد دقيقة حية مع نبضات الليزر عالية الطاقة وتحليل لاحقة من هذه الإصابات والشفاء مع مرور الوقت. نعرض أيضا كيف وصفت واحدة أو وراثيا يمكن تتبع مجموعات من خلايا عضلات الهيكل العظمي أثناء وبعد ضوء الليزر التي يسببها الضرر.

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

يوصف التصوير التنمية الدماغية في الزرد اليرقات. كما يتم توفير التقنيات اللازمة لتسهيل 3D التصوير وتعديل وضع الدماغية باستخدام العلاجات الكيميائية.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

بعد transection الشوكي، الزرد الكبار يكون الانتعاش وظيفية لمدة ستة أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الشفافية اليرقات والانتعاش بشكل أسرع، ونحن نقدم وسيلة لtransecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، نلاحظ الانتعاش الحسية ابتداء من الساعة 2 أيام بعد الإصابة، وحركة C-منحنى قبل 3 أيام بعد الإصابة.

Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

لتسليط الضوء على الآليات الخلوية والجزيئية لتكوين الخلايا العصبية للبالغين لأسماك الزرد وتجديدها ، قمنا بتطوير بروتوكول للجراحة الغازية التي تسبب إصابات ميكانيكية في telencephalon البالغ لسمك الزرد والمراقبة اللاحقة للتغيرات في نصف الكرة المخية المطعون عن طريق الكيمياء المناعية أو التهجين في الموقع.

طعنة الإصابة بالجروح من اسماك الزرد الكبار الدماغ الانتهائي: طريقة المعنية بالتحقيق في تكوين الخلايا العصبية والدماغ الفقارية التجديد

يعتبر سمك الزرد نظاما نموذجيا ممتازا للدراسات الجينية والتنموية. زرع الخرزة هو تقنية قيمة لمعالجة الأنسجة يمكن استخدامها لاستجواب آليات النمو عن طريق إدخال تغييرات في البيئات الخلوية المحلية. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء زرع الميكروبيدات في جنين الزرد.

Microbead زرع الأجنة الزرد

الهدف من هذا البروتوكول هو تفصيل طريقة جديدة لتقييم وظيفة القلب القطاعية في سمك الحمار الوحشي الجنيني في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية.

تحليل النزوح من تشوه عضلة القلب الميكانيكية (DIAMOND) يكشف التغايرية القطعية لوظيفة القلب في حمار وحشي الجنيني

قمنا بتعديل نموذج انخفاض الوزن Marmarou لسمك الحمار الوحشي الكبار لفحص اتساع نطاق الأمراض بعد إصابات الدماغ الرضية القوة الحادة (TBI) والآليات الكامنة وراء تجديد الخلايا العصبية اللاحقة. هذا النموذج TBI قوة حادة قابلة للتطوير، ويحفز TBI خفيفة، معتدلة، أو شديدة، ويستعرض عدم التجانس الإصابة لوحظ في TBI الإنسان.

نموذج قابل للتطوير لدراسة آثار إصابة القوة الحادة في سمك الحمار الوحشي البالغ

تم وصف طريقة حقن جديدة داخل الصفاق (IP) في الزرد البالغ. عند التعامل مع المركبات السامة مثل دوكسوروبيسين ، يكون هذا الإجراء أكثر فعالية من طريقتي IP المبلغ عنهما سابقا. تم تصميم هذه التقنية ليتم اعتمادها بسهولة من قبل الباحثين ذوي الخبرة المحدودة في نموذج الزرد.

تقنية الحقن داخل الصفاق في أسماك الزرد البالغة التي تقلل من تلف الجسم والوفيات المرتبطة به

يحدد هذا البروتوكول طريقة لتطعيم حبة مغناطيسية في قلب سمكة الزرد النامية من خلال الجراحة المجهرية ، مما يتيح التلاعب بالقوى الميكانيكية في الجسم الحي وتحفيز تدفق الكالسيوم المعتمد على التحفيز الميكانيكي في خلايا الشغاف.

التلاعب بالقوى الميكانيكية في قلب الزرد النامي باستخدام الخرز المغناطيسي

يصف هذا البروتوكول طريقة الفحص المجهري الضوئي منخفضة التكلفة لتقييم مورفولوجيا القلب ووظيفته في أجنة الزرد ، مما يتيح تقييما قابلا للتكرار لسمية القلب التنموية دون الحاجة إلى أنظمة تصوير متقدمة.

التصوير الوظيفي للقلب في أجنة أسماك الزرد باستخدام الفحص المجهري القياسي وتحليل الفيديو: تطبيقات في البحوث البيئية والطبية الحيوية

تعلم إصابة الأوعية الدموية ميكانيكياً في أجنة سمك الزرد لدراسة تخثر الدم والالتهابات. تتيح هذه الطريقة رصد شفاء الجروح بالمجهر الزمني في نموذج حي شفاف.

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

استكشف المزيد من الفيديوهات