Name: قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: اكتشف تقنية قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي لتحديد مثبطات بروتين HIV-1 NC بسرعة. تستخدم هذه الطريقة تسلسلات RNA محددة والتحليل بالتكهرب الكهربائي دون الحاجة للتسميع الإشعاعي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) وMIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

<ol><li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li>
<li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+functions%2C+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li>
<li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li>
<li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features%2C+processing+states%2C+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleation%2C+reverse+annealing%2C+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li>
<li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li>
<li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li>
<li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li>
<li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li>
<li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li>
<li>Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA%2FDNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li>
<li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization%2C+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+Protein%3A+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22MedChemComm%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li>
<li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones%3A+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Chemmedchem%22%5BJournal%5D)">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li>
<li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li>
<li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+RNA+chaperone+proteins%3A+from+functions+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li>
<li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li>
<li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li>
<li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li>
<li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

الاسم هو الفحص الذي يسمح لتقييم بسرعة تثبيط النشاط كوصي من البروتين قفيصة منواة من HIV-1، هدفا للاهتمام في البحث عن أدوية جديدة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. NC anneals سريع في درجة حرارة الغرفة والأحماض النووية التي لولاها لتمسخ الحراري في درجة حرارة عالية تليها الصلب الدقيق للطي مستقر. الفحص لا يمكن أن يؤديها مع أي من كامل طول NC أو مع اقتطاع (12-55) NC: في كلتا الحالتين هي صلب اثنين من الأحماض النووية (RNA ونسخة من DNA التكميلية) بسرعة. وهذا يتفق مع الملاحظة الأدب مع NC الببتيد اقتطاع: يبدأ الصلب من قبل ذوبان كفاءة تنبع من cTAR تليها تفاعل حلقة قمية المكملة له، وهو ضعيف الموقع ملزمة NC، مع تسلسل تكميلية من TAR حلقة قمية، تنتهي خلال عدة سيطة غير مستقرة إلى هجين صلب الموسعة. 21 NC هو البروتوكول الاضافي مستقرة جداعين وبعض المشاكل أثناء أداء الاسم يمكن ان تحدث. من المهم جدا ولكن لإضافة SDS تقدم طازجة في تحميل جل المستخدمة العازلة لوقف رد الفعل: إذا كان هذا لم يتحقق، فإن جل لا تظهر عصابات الحمض النووي في المواضع الصحيحة. في الواقع، NC هو حمض ملزمة البروتين النووي، بحيث لتصور بشكل صحيح TAR / cTAR مضاعف متغاير من قبل الكهربائي للهلام SDS يجب أن تكون موجودة في جل للتحميل العازلة لتفسد البروتين والافراج عنها من مجمعها ضيق مع الأحماض النووية. وهذا هو أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكن من التجربة، أي تشكيل عصابات تحولت خلال الفترة السابقة هلام. هذا التأثير واضحا بشكل خاص عندما كان يعمل على كامل طول NC، كما في الشكل 2، ويرتبط وجود الذيل N-محطة الأساسي للغاية، وجود تأثير لتجميع قوي على الأحماض النووية. وجود الذيل الأساسي محطة يجعل رد الفعل الصلب أكثر صعوبة أن يكون مستعمل، كما تظهرن في الشكل (3) باستخدام مركب 1، خيوط intercalator التمثيلية، أي بزيادة intercalator درجة من الكفاءة خاصة في استقرار الهياكل الجذعية حلقة من القطران وcTAR. في الواقع، يفضل هذا النوع من التفاعل مع الأحماض النووية عندما الانتفاخات والحلقات يقطع استمرارية الحلزون المزدوج، مما يسمح للخيوط أسهل من بدائل ضخمة في أزواج قاعدة. استقرار TAR وcTAR من قبل هذه المجلدات الحمض النووي تم تحليلها من قبل تحديد الزيادة في درجة حرارة انصهار من [أليغنوكليوتيد اثنين (14). وعلاوة على ذلك، فإن الزيادة في درجة حرارة انصهار يرتبط مع تثبيط الصلب يحفزه HIV-1 NC، مما أدى إلى تشكيل المخفضة للTAR مضاعف متغاير / cTAR ومما يدل على أن intercalators خيوط هي فئة مثيرة للاهتمام من لدنة لهياكل ديناميكية من RNA مثل عنصر TAR 14 آلية عمل لجأت لهذه كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي يمكن التحقق من صحة أبعد عن طريق إجراء فحص الاسم في صيغ بديلة مختلفة، كما هو مبين في الشكل (4): في حالة intercalators تتعزز تثبيط مضاعف متغاير صلب عند المحتضنة المخدرات مع اثنين من oligos مطوية. المركبات التي تعمل مع آلية مختلفة للعمل، مثل المواد اللاصقة مباشرة من البروتين NC، ستكون أقل تأثرا وضع حضن مسبق مختلف. اسم الفحص التي أجريت في طريقتين بالتالي يمكن أن تستخدم لفحص المكتبات من المركبات لتحديد مثبطات NC، وكذلك لتقييم آلية المفترضة عمل يضرب إيجابية أثناء البحث عن العقاقير المضادة للفيروس نقص المناعة البشرية تستهدف NC. ومن الواضح أن استخدام هذه التقنيات وحدها عند المطالبة بالتعويض عن آلية عمل محددة من مثبطات NC حددت ليست كافية، وهناك حاجة أخرى فحوصات الكيمياء الحيوية المناسبة للحفاظ على فرضية العمل (14). وأخيرا، فإنه يجب التأكيد على أن الاسم يستخدم للغايةالانزيمات المنقى، إما المؤتلف أو الاصطناعية، وإعطاء المعلومات الثمينة على &quot;في المختبر&quot; تثبيط NC بواسطة مركبات اخضعت للاختبار. هذا هو &quot;القوة والضعف&quot; للمقايسة: الاسم يمكن أن تكمل أيضا فحص الظاهري ونهج النمذجة الجزيئية في الخطوات الأولية لبرامج اكتشاف الأدوية، مما يتيح لبناء بسرعة وتحليل العلاقات هيكل النشاط في نهاية المطاف إعادة توجيه التوليف والمخدرات التصميم. لكن، وكما فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى المستخدمة في مشاريع التنمية المخدرات في فيروس نقص المناعة البشرية، اسم لن تعطي معلومات عن آثار مثبطات المفترضة في الخلايا المصابة بالفيروسات.

البروتين قفيصة منواة NCp7 (NC) من فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (HIV-1) هو والبروتين الأساسي الصغير الذي يرتبط بشكل وثيق مع RNA الجيني في الفيروسات المعدية ناضجة، ولعب دورا محوريا في تكاثر الفيروس بمثابة العامل المساعد خلال النسخ العكسي والاعتراف الجينوم، والتعبئة والتغليف. 1-3 NC بمثابة كوصي الحمض النووي تحفيز زعزعة استقرار الهياكل الحمض النووي والصلب من تسلسل التكميلية. نشاطها الحمض النووي تجميع يقيم في المقام الأول في الأحماض الأمينية 11 نطاق N-المحطة في حين تم تعيين النشاط زعزعة استقرار دوبلكس للهياكل إصبع الزنك لها (12-55 الببتيد). 4 البروتين موجبة الشحنة يقلل من الحاجز الكهربائي من رد فعل الصلب و يزيد من المعدل الذي اثنين من سلاسل تكميلية منفصلة معا. الأحماض النووية مطوية في التشكل مستقرة وتتطلب أنشطة كوصي من NC إلى facilitatالبريد الصلب من 5 وهذا أمر مهم لا سيما في النسخ العكسي، حيث NC أمر بالغ الأهمية في نقل الأحداث حبلا: في نقل ناقص حبلا، وDNA توقف ناقص حبلا، retrotranscribed فقط، يجب أن يتم نقل وصلب لتسلسل مكمل في المنطقة R في &#39;نهاية 3 من الجينوم RNA القالب. 6 على الرغم من أن يفضل الديناميكا الحرارية، لا يحدث هذا التفاعل على نطاق واسع في غياب NC بسبب وجود هيكل مستقر في المنطقة استجابة تفعيل المتحولة (TAR) RNA في المناطق R، يجب أن تكون مرتبطة إلى نسخة الحمض النووي (DNA cTAR). 7 مناطق هي، في الواقع، منظم للغاية cTAR وTAR ذات صفة الجذعية حلقة التشكل. البروتين NC يبدل طبيعة هذه دبابيس الشعر، ويعزز نقل حبلا ناقص عن طريق زيادة معدل الصلب الجزيئات بين التكميلية جدائل الحمض النووي. وقد تم التحقيق آلية NC الصلب من تقرير التقييم الثالث وcTAR بدقة وديمكتوب كما فحص TAR الصلب في العديد من الأوراق البحثية ويصور الخطة المقترحة في الاستعراضات ممتازة. 8-11 التلخيص، NC يزعزع استقرار هيكل الثانوي من الحمض النووي الريبي مستقر مثل TAR-RNA، يزعزع استقرار هيكل الثانوي للتسلسل التكميلي، cTAR-الحمض النووي ، ويعزز رد الفعل الصلب من RNA / DNA مما يؤدي إلى TAR / cTAR تشكيل مضاعف متغاير. 10،11 ونتيجة لذلك، يفضل الخطوة حبلا نقل أثناء النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية. 12 NC غير هدفا جذابا لتطوير العوامل المضادة للفيروسات جديد منذ ان التداخل المحتمل الناجم عن جزيئات صغيرة نحو NC يؤدي إلى الحد من النسخ العكسي من الجينوم الفيروسي نتيجة لنشاط NC خطر. 2،13 يمكن هذا النهج تؤدي في النهاية إلى تطوير عوامل نجاح مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. في سياق عملية غربلة لNC مثبطات 14 ضعنا مقايسة الاعتماد على الخصائص المعروفةمن قفيصة منواة لزعزعة استقرار بكفاءة ويصلب [أليغنوكليوتيد التكميلية. نحن 10،11 يطلق عليه ucleocapsid N A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) فحص. يستخدم اسما وفحص NC للتوسط في الصلب بين نسخ منظم ثابت من الأحماض النووية التكميلية، في حالتنا من قليل النوكليوتيد الموافق الجزء القمي من سلسلة TAR-RNA مع تسلسل الحمض النووي لها التكميلي (cTAR) لانتاج الهجين TAR / cTAR مضاعف متغاير . ويمكن التحقيق في تحليل تقرير التقييم الثالث / cTAR الصلب رد الفعل في وجود NC التي كتبها الأصلي الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (PAGE). ويظهر هذا البروتوكول كيفية إجراء الفحص الاسم ليصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة [أليغنوكليوتيد مطوية في الهياكل منعطف حاد مستقرة، وكيفية تحليل نتائج تفاعل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكنا من التجربة. لا يطلب وضع العلامات المشع للحامض النووي، وdetectiعلى العصابات قليل النوكليوتيد يمكن أن يقوم بها وسائل تلطيخ التقليدية. الفحص، التي توظف إما المؤتلف بروتين كامل طول أو نسخة تركيبية اقتطاع من NC، يسمح بتحديد intercalators خيوط تثبيط NC، وهو نشاط تبين أن ترتبط مع ملزمة قوية لRNA والحمض النووي (14).

<table><tbody><tr><td>cTAR ، 29-mer DNA oligo. محلى. HPLC منقى.</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>تخزين حل المخزون في -20 درجة ؛ ج&nbsp;</td></tr><tr><td>TAR ، 29-mer RNA oligo. محلى. HPLC منقى.&nbsp; &nbsp;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>قم بتخزين سعر المخزون عند -80 درجة ؛ ج&nbsp;</td></tr><tr><td>(12-55) NC الببتيد</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>تخزين محلول المخزون عند -20 درجة ؛ أنابيب</td></tr><tr><td>C 1.5 مل</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>الأوتوكلاف قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>أنابيب 0.5 مل</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>الأوتوكلاف قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>نصائح مرشح المحيط الحيوي 0.1-10 & micro ؛ ل</td><td>Sarstedt</td><td>701،130،210</td><td></td></tr><tr><td>نصائح مرشح المحيط الحيوي 2-20 & micro ؛ ل</td><td>Sarstedt</td><td>70،760،213</td><td></td></tr><tr><td>نصائح مرشح المحيط الحيوي 200 &nbsp ؛ ومايكرو. ل</td><td>Sarstedt</td><td>70،760،213</td><td></td></tr><tr><td>مرشح حقنة 0.22 &nbsp ؛ ومايكرو. م</td><td>Biosigma srl</td><td>51،798</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول</td><td>كارلو إربا</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الصوديوم دوديسيل</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>71725-50 جم</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>71376-1 كجم</td><td></td></tr><tr><td>حمض البوريك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>B0252-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>المغنيسيوم بيركلورات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>222283-100G</td><td>تخزين 1 & nbsp ؛ حل M في -20 &nbsp ؛ &deg; C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;,N&prime; < / م >-تتراميثيلإيثيلين ديامين</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>بيرسولفات الأمونيوم</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>A7460-500G</td><td>تحضير محلول 10٪ طازجا قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>محلول أكريلاميد مكرر جاهز للاستخدام 40٪ (19: 1)</td> <td>ميرك ميليبور</td><td>1006401000</td><td>بولي أكريلاميد شديد السمية للأعصاب: ارتد القفازات أثناء صب الهلام</td></tr><tr><td>Tris ultra Pure</td><td>Applichem</td><td>A1086 ، 1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC المياه المعالجة</td><td>Ambion</td><td>AM9922</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>الطرد المركزي 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>22،621،408</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 مطياف</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Lambda 20</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-1803</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac امدادات الطاقة الأساسية</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II RNA Gel Staining</td><td>Lonza</td><td>50523</td><td>اصنع التخفيف 1 / 10,000 في TBE 1x. قم بتخزينه في الظلام عند 4 &nbsp ؛ &deg; ج لمدة أسبوعين.</td></tr><tr><td>نظام التصوير Geliance 600</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (name) الفحص يسمح للتحديد السريع لhiv-1 قفيصة منواة مثبطات

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA أو DNA مطوية في للطي ثلاثي الأبعاد مستقر أهدافا مثيرة للاهتمام في تطوير انتيتومور أو الأدوية المضادة للفيروسات. في حالة HIV-1، والبروتينات الفيروسية المشاركة في تنظيم نشاط الفيروس تعترف عدة الأحماض النووية. البروتين قفيصة منواة NCp7 (NC) هو بروتين أساسي ينظم عدة عمليات خلال تكاثر الفيروس. NC هو في الواقع كوصي زعزعة استقرار الهياكل الثانوية من الحمض النووي الريبي والحمض النووي وتسهيل الصلب الخاصة بهم. وتثبيط NC هو نهج جديد وهدفا للاهتمام للعلاج لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. ucleocapsid على N A nnealing- M ediated E lectrophoresis تم تطوير (NAME) فحص لتحديد الجزيئات قادرة على منع ذوبان والصلب من الحمض النووي الريبي DNA ومطوية في التشكل ثلاثي الأبعاد مستقرة الديناميكا الحرارية، مثل الهياكل دبوس الشعر من القطران وعناصر cTAR من فيروس نقص المناعة البشرية، من خلال البروتين قفيصة منواة من HIV-1. فحص جديد يستخدم إما إعادةcombinant أو البروتين المركب، و[أليغنوكليوتيد دون الحاجة لوضع العلامات السابقة. ويتحقق تحليل النتائج وفقا لمعيار الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (PAGE) تليها التقليدي تلطيخ الحمض النووي. يصف بروتوكول ورد في هذا العمل كيفية إجراء الفحص الاسم مع بروتين كامل طول أو إصدار اقتطاع لها تفتقر المجال N-المحطة الأساسية، سواء المختصة كما الأحماض النووية المحرمين، وكيفية تقييم تثبيط NC النشاط كوصي من قبل خيوط intercalator. وعلاوة على ذلك، الاسم يمكن أن يؤديها في وضعين مختلفة، من المفيد الحصول على مؤشرات حول آلية المفترضة عمل مثبطات NC التي تم تحديدها.

ويبين الشكل 1 نتيجة تمثيلية من قفيصة منواة التليين وساطة الكهربائي (NAME) الفحص، يقوم ط) مع المؤتلف بروتين كامل طول، والثاني) من دون البروتين، أي خلط cTAR + TAR واحتضان ما يصل إلى 1 ساعة على RT، والثالث ) نفس الفحص يؤديها مع (12-55) NC، الببتيد الاصطناعية تفتقر إلى 11 الأحماض الأمينية المجال N-المحطة. وكان تقرير التقييم الثالث مطوية مسبقا وcTAR المختلط وتشكيل TAR مضاعف متغاير صلب / تم رصد cTAR بحضور كامل طول المؤتلف NC (الممرات تبقى من الشكل 1)، في حالة عدم وجود بروتين (الممرات المركزية في الشكل (1) )، وبحضور من اقتطاع (12-55) NC الببتيد (الممرات الصحيحة في الشكل 1). الضوابط هي: مطوية cTAR، مطوية TAR، وصلب هجين (TAR / cTAR)، التي تم الحصول عليها من خلال تمسخ الحراري للهياكل مطوية ثابت من تقرير التقييم الثالث للcTAR تليها annealin البطئز (14). قدرة NC لتفسد اثنين مستقرة تسلسل الحمض النووي في الحلزون مضاعف متغاير بمد هو واضح بشكل واضح: كامل طول البروتين NC يؤدي على الفور إلى تشكيل TAR / cTAR الهجين: 0 &#39;يشير إلى الحد الأدنى من الوقت يمر بين إضافة NC ل العينات وإضافة عازلة هلام التحميل، الذي يتوقف رد الفعل. ويتحقق تشكيل كامل بالفعل بعد 15 &#39;فترة حضانة. الزيادة في شدة مضاعف متغاير صلب يوازي الانخفاض في شدة مطوية cTAR وTAR أليغنوكليوتيد]. ويتحقق تشكيل مضاعف متغاير أيضا في وجود شكل اقتطاع، أي (12-55) NC، مؤكدا النشاط البيولوجي من الببتيد الاصطناعية. سوف في غياب البروتين أو الببتيد لا لوحظ تشكيل مضاعف متغاير، وتقرير التقييم الثالث و[أليغنوكليوتيد cTAR لا يصلب في درجة حرارة الغرفة في مضاعف متغاير (الشكل 1). فيكل التجارب، وتشكيل سريع وسيطة غير مستقرة (&quot;المجمعات وسيطة&quot; في الشكل رقم 1) التي تقلل مع مرور الوقت لوحظ، على الدوام مع الآلية المقترحة الصرف حبلا من خلال دبابيس الشعر من cTAR وTAR حتى الأحماض النووية الصحيحة للطي (17). واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكن من التجربة هو عدم وجود SDS في المخزن المؤقت جل تحميل. في غياب SDS في GLB يظهر نتيجة للتفاعل في الشكل 2 ومقارنة نتائج مع GLB + SDS. وكان تقرير التقييم الثالث مطوية مسبقا وcTAR المختلط وحضنت لمدة 3 ساعة على RT لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية مع كامل طول البروتين NC المؤتلف. بعد مرور فترة الحضانة تم تقسيم العينات في اثنين: واحد نصف هلام العازلة تحميل دون SDS (GLB) وأضافت، في حين أن النصف الآخر كان GLB مع SDS (GLB SDS). تم تحميل عينات على هلام، وتصور الموقف من الأحماض النووية العصابات بعد هلام تديرهاصبغ تلطيخ. عندما كان NC الحالي ولكن تم تحميلها العينات مع GLB، تم نقل جميع الأحماض النووية العصابات الأعلى: هذا ومن المتوقع ويشير إلى ملزمة قوية بين البروتين والأحماض النووية. وتظهر النتائج مع GLB SDS في اليمين المتطرف من هلام: إضافة SDS يبدل طبيعة البروتين والنشرات الأحماض النووية من مجمع مستقرة مع البروتين، والسماح للمقارنة مع الضوابط. يتم استخدام فحص الاسم لتقييم قدرة خيوط intercalators لتحقيق الاستقرار في الهياكل الحمض النووي ديناميكية وتمنع NC النشاط كوصي 14 intercalators خيوط هي جزيئات العطرية مستو الاستعاضة عن السلاسل الجانبية ضخمة تقع في مواقع نقيض من نظام عصابة، مثل أنثراكوينون هو مبين في الشكل 3A. 18 هذه intercalators قادرة على خيط من خلال الحلزون المزدوج من الأحماض النووية، وتحديد مكان أخيرا سلاسل جانبهم في كل أخدود من ضعفالحلزون. 19،20 ويبين الشكل 3B نتائج الفحص الاسم في وجود مركب 1، intercalator خيوط معروف، 18 بحضور كامل طول NC أو من الببتيد اقتطاع. في كلتا الحالتين، يتم تقليل تشكيل هجين TAR / cTAR التي كتبها NC عن طريق زيادة تركيز intercalator، بينما، في الوقت نفسه، ومقدار TAR الحرة وزيادة cTAR. شكل اقتطاع من البروتين تفتقر الذيل N-محطة (12-55NC) هو أكثر حساسية لتثبيط نشاطه: تم التحقق من هذا الاختلاف مع جميع مركبات اخضعت للاختبار حتى الآن. الفحص الاسم يمكن أن يؤديها بطريقتين، إما عن طريق ما قبل يحتضنها مجمع الاختبار مع NC، تليها إضافة [أليغنوكليوتيد مطوية (وضع NC-حضن مسبق)، أو عن طريق preincubating مجمع اختبار لمدة 15 دقيقة مع ركائز الحمض النووي مطوية ، تليها إضافة NC وحضانة أخرى لمدة 15 دقيقة (بنسبة ضئيلة من العلاقات العامةوضع eincubation). على الرغم من أن فترة حضانة العام هو نفسه في اثنين من وسائط مختلفة، وحضن مسبق مع [أليغنوكليوتيد مطوية قبل إضافة NC يسمح لمزيد من الوقت لخيوط من intercalators في الحمض النووي مطوية. وهذا يؤدي إلى استقرار أقوى من هياكلها ديناميكية وإلى تثبيط أسهل من الأنشطة كوصي NC. وبالتالي فإن تحليل الفحص الاسم في وضعي يعزز الاختلافات في آلية عمل مثبطات NC، كما هو مبين في الشكل (4): عندما تم تحليل مركب 1 حسب الاسم في وضع بنسبة ضئيلة من حضن مسبق (الشكل 4، والممرات في اليسار) فإنه يدل تثبيط قوية من الصلب NC بوساطة، في حين لوحظ أقل بكثير تثبيط في وضع NC-حضن مسبق (الشكل 4، والممرات في اليمين). يرجى ملاحظة أن لتحديد تركيزات المثبطة بينما فحص مجموعات من المركبات ذات الصلة مع هذا الاختبار وفي هذه الظروف، كل جتربةمنة يجب أن يؤديها على الأقل في ثلاث نسخ باستخدام تركيزات المتقاربة (خاصة حول قيمة IC 50) (14). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> الشكل 1: اسم الفحص مع كامل طول NC ومع اقتطاع (12-55) NC TAR مطوية وcTAR، كل 1 ميكرومتر، وحضنت مع المؤتلف NC أو مع (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) ل0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة و 1 ساعة. استخدمت TAR وcTAR المحتضنة في غياب البروتين (0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة و 1 ساعة) كما المراقبة السلبية. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR الهجين / cTAR تم الحصول عليها بعد تمسخ الحراري تليها كانت تستخدم في المختبر الصلب والضوابط. وكان رد فعل ثم توقفت عن استخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator. <html><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> الشكل 2: تأثير SDS العازلة في هلام تحميل (GLB) عند تحليل TAR / cTAR الصلب التي كتبها NC TAR وcTAR، prefolded في TNMg 1X، وحضنت مع كامل طول المؤتلف NC (oligos / NC = 1/8) لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو في 37 ° C. GLB أو GLB SDS ثم تم إضافتها إلى عينات المحتضنة مع NC. الضوابط: TAR، cTAR وTAR الهجين صلب / cTAR (كل 1 ميكرومتر). تم إجراء الكهربائي باستخدام هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator. تم تعديل هذا الرقم من الشكل S4 من: Sosic، A. وآخرون التصميم والتركيب والتقييم البيولوجي للTAR والمجلدات cTAR كما HIV-1 قفيصة منواة مثبطات MedChemComm 4، 1388-1393، دوى: 10.1039 / c3md00212h (2013) . &quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> الشكل (3): (A) التركيبة الكيميائية للخيوط intercalator 1. (ب) تأثير خيوط intercalator 1 المقررة من قبل اسم الفحص. مطوية TAR وcTAR، كل 1 ميكرومتر، وحضنت في وجود تركيزات أشار المجمع 1 مع كامل طول NC أو مع (12-55) NC، كل 8 ميكرومتر. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR مضاعف متغاير الموسعة / استخدمت cTAR والضوابط. وكان رد فعل ثم توقفت عن استخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> الشكل 4: بنسبة ضئيلة من حضن مسبق مقابل سائط NC-حضن مسبق: الآثار على اسم الفحص بنسبة ضئيلة من حضن مسبق وزارة الدفاع.البريد: TAR مطوية ومطوية cTAR، كل 1 ميكرومتر، تم preincubated مع تركيزات المشار إليها من خيوط intercalator 1 لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك لمدة 15 دقيقة إضافية في وجود كامل طول NC (8 ميكرومتر) NC-حضن مسبق. الوضع: تركيزات المشار إليها من خيوط intercalator 1 تم preincubated مع كامل طول NC (8 ميكرومتر) لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك لمدة 15 دقيقة إضافية في وجود TAR مطوية ومطوية cTAR، كل 1 ميكرومتر. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR مضاعف متغاير الموسعة / استخدمت cTAR والضوابط. وجميع ردود الفعل توقفت أخيرا باستخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator.

يصف هذا البروتوكول NAME ، وهو اختبار يسمح بالتعرف السريع على الجزيئات القادرة على تثبيط أنشطة مرافق بروتين نوكليوكابسيد فيروس نقص المناعة البشرية -1 في المختبر.

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

الهدف العام من التجربة هو التعرف السريع على الجزيئات القادرة على تثبيط أنشطة البروتين المرافق لبروتين القفيصة النووية لـ HIV one. يُعد NC في المختبر بروتيناً صغيراً وقلوياً للغاية، وتتميز بنيته بنطاق طرفي مرن وبإصبعين من الزنك محفوظين للغاية يشاركان في التفاعل مع الأحماض النووية الفيروسية. يتفاعل NC مع دبوس شعر tar RNA وتسلسله المكمل من DNA وهو CT A r، ويعزز صهر بنيتيهما الثانوية لجعلهما متاحين لارتباط هجين tartar.يتم تنفيذ البروتوكول باستخدام الجزء القمي من تتابعات tar و sitar عند خلطهما معاً وتحضينهما مع nc. يتكون الهجين من خلال التشابك والمداورات التي تتفاعل مع oligonucleotides التي تثبط تكوين الهجين المحفز بواسطة NC. يتم تحليل نتيجة التفاعل عن طريق الفصل الكهربائي للهلام باستخدام بولي أكريلاميد القياسي، حيث يمتلك TAR و CA حركية مختلفة في الهلام مقارنة بالهجين.تؤدي زيادة تركيزات التشابك في المجمعات البينية إلى انخفاض الهجين بالتوازي مع ظهور القطران الحر و CT A. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالبروتوكولات الحالية، مثل تحليل إزاحة الهلام أو ثني القطران، في أنها لا تتطلب معالجة أولية للأحماض النووية مثل الوسم الإشعاعي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال اكتشاف الأدوية، مثل مثبطات HIV one و C بشكل عام لدى الأفراد. وبما أننا جدد على هذه الطريقة، فإننا نواجه صعوبة في التنظيم العام للبروتوكول، لاسيما في التخفيف التسلسلي لكل مخزون، ووقت الحضن الدقيق، والإجراء الصحيح لإيقاف التفاعل.لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير 10 µL من المحلول المخزون لأوليغونوكليوتيد tar بتركيز 1 µM و 10 µL من CT A بتركيز 1 µM في منظم TNMG بتركيز 1X. سخّن الأنابيب إلى حوالي 95 °C لمدة خمس دقائق، ثم بردها إلى درجة حرارة الغرفة لكي يستعيد كل من TAR و CT A هياكل العروة المنتفخة للساق (stem bulge loop structures). ولتحضير محلول بتركيز 1 µM من هجين tar CT A كعينة ضابطة، اخلط 1 µL من tar بتركيز 10 µM مع 1 µL من CT A بتركيز 10 µM في منظم TNMG بتركيز 1X.املأ الأنبوب بماء DEPC حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 10 µL. بعد ذلك، قم بمسخ قليلات النوكليوتيد عن طريق تسخين الأنبوب عند 95 °C لمدة خمس دقائق. اتركه ليبرد ببطء حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة لكي يترابط tar مع تسلسله المكمل CT A ويكوّن الهجين ثنائي السلسلة tar CT A. عندما تبرد جميع المحاليل إلى درجة حرارة الغرفة، قم بإجراء طرد مركزي سريع، ثم أضف 3 µL من محلول GLB مع SDS إلى كل محلول وقم بخلطه داخل الأنبوب ثلاث مرات.ضع العينات على الثلج حتى خطوة التحميل. في هذا الإجراء، قم بتحضير 10 µL من تخفيفات المركب one بتركيزات 500 µM و250 µM و50 µM و5 µM في ماء milli Q. ثم قم بتحضير 27.5 µL من tar بتركيز 4 µM و27.5 µL من CTA بتركيز 4 µM في منظم TNMG 1X.قم بتسخين الأنبوبين إلى حوالي 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق من أجل طي البنى، واستخدم 2.5 µL من هذه المحاليل من قليلة النوكليوتيد المطوية في الخطوات التالية. بعد ذلك، خفف المحلول المخزون لكل من بروتين NC و NC 12 to 55 peptide في الماء إلى 80 µM. عندما تبرد محاليل TAR و CAR إلى درجة حرارة الغرفة، قم بإجراء طرد مركزي سريع (short spin) لكلا الأنبوبين، ثم جهز 20 أنبوباً فارغاً ومعقماً بالأتوكلاف، وضع صفين يتكون كل منهما من 10 أنابيب في الحامل المخصص لعينات المختبر.بعد ذلك، أضف 2.5 µL من tar المطوي إلى كل أنبوب في الصف الأول. ثم أضف 2.5 µL من CT A المطوي إلى كل أنبوب. وفي الصف الثاني، أضف 2 µL من المركب المناسب، تخفيفاً واحداً لكل من tar و CT A r.استبدل المركب بالماء في العينات الخاصة بتحليل NC وببتيد NC 12 to 55 في مجموعات الضبط. حضن العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور 15 دقيقة، اخلط عينات CT A R مع عينات tar المقابلة لها.أضف 1 µL من NC بتركيز 80 µM إلى العينات المخصصة لتحليل NC، أو 1 µL من NC 12 to 55 peptide بتركيز 80 µM إلى العينات المخصصة لتحليل NC 12 to 55 peptide. وبعد تحضين إضافي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أوقف التفاعل بإضافة 3 µL من GLB المحتوي على SDS إلى كل عينة. اخلط المزيج في كل أنبوب باستخدام الماصة ثلاث مرات، ثم ضعه على الثلج.كرر هذه الخطوة باستخدام العينات الخاصة بتحليل NC وببتيد NC 12 to 55، واحفظ العينات على الثلج حتى خطوة التحميل. الآن، قم بإزالة غطاء جهاز الفصل الكهربائي للهلام. حمّل 13 µL من كل عينة في الآبار.أغلق غطاء جهاز الفصل الكهربائي للهلام قبل تشغيله. قم بتشغيل الهلام لمدة ساعتين و30 دقيقة عند جهد ثابت قدره 200 فولت حتى تهاجر الصبغة إلى مسافة 1.5 سنتيمتر فوق قاع الهلام. بعد ذلك، ضع الهلام في وعاء مناسب مع محلول صبغ الأحماض النووية المطلوب لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة مع التقليب المستمر.ضع الهلام على نظام تصوير بجهاز ترانسلوميناتور للكشف عن الأحماض النووية من خلال الإشارة الفلورية. يُستخدم هذا المقايسة لتقييم قدرة المداخلات المتداخلة (threading intercalators) على تثبيت البنى الديناميكية للأحماض النووية وتثبيط نشاط المرافقات النووية (NC chaperone). المداخلات المتداخلة هي جزيئات عطرية بسيطة مستبدلة بسلاسل جانبية ضخمة تقع على الجانبين المتقابلين من النظام الحلقي، مثل الأنثراكينون الموضح هنا.يوضح هذا الشكل نتيجة مقايسة الاسم في وجود المركب one، وهو مادة معروفة تداخل خيطية، في وجود NC كامل الطول أو الببتيد المبتور. في كلتا الحالتين، ينخفض تكوين tar ct، وهو هجين بواسطة NC، مع زيادة تركيز المادة المتداخلة. وفي الوقت ذاته، تزداد كمية tar و CT A R الحرة.عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام منظم تحميل JA مع SDS. تعد هذه الخطوة حاسمة لتحقيق النجاح الأمثل لـ name. فعلى سبيل المثال، إذا لم يتم اتباع هذه الخطوة، فلن يكون من الممكن تمييز حزم الحمض النووي في نظام الهلام.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء MSA لأي oligonucleotides في درجة حرارة الغرفة مطوية في هياكل airplane غير مستقرة، وكيفية تحليل نتيجة التفاعل، باستخدام إما بروتين NC الكامل المؤتلف أو ببتيد NC اصطناعي مقتطع لتحديد interpolators التداول التي تثبط nc. لا تنسَ أن العمل مع intercos والـ poly acrylamide يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا البروتوكول.

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

Uncoating هو خطوة ضرورية في مرحلة مبكرة من دورة الحياة HIV - 1 ، ويعرف بأنه تفكك قذيفة قفيصة والإفراج عن مجمع بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNP). هنا ، علينا أن نظهر تقنيات لعزل نواة سليمة من virions HIV - 1 لقياس وuncoating...

Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

نحن هنا وصف السمسة الخلوية واحد المقايسات العدوى الجولة التي تتيح لفحص سريع ودقيق من المركبات لتحديد السمسة الخلوية الخاصة بهم (CC 50) وIC 50 ضد القيم WT ومقاومة HIV-1 المخدرات.

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

مطلوب فهم مطابقات المستضدات السطحية الفيروسية لتقييم تحييد الأجسام المضادة وتوجيه تصميم الجينات المناعية الفعالة للقاح. نصف هنا اختبار ELISA القائم على الخلايا والذي يسمح بدراسة التعرف على فيروس نقص المناعة البشرية -1 الثلاثي المعبر عنه على سطح الخلايا المنقولة بواسطة أجسام مضادة محددة مضادة ل Env.

تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

توفر منافسة النمو بين الفيروسات المتساوية الجينية تقريبا مقياسا حساسا لتحديد لياقة النسخ المتماثل النسبية. تشمل البروتوكولات الموصوفة هنا بناء استنساخ فيروس نقص المناعة البشرية -1 المؤتلف ، وانتشار الفيروس ومنافسة النمو وطرق التحليل المحسنة لتحقيق نتائج حساسة ومتسقة.

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

نحن هنا وصف الورقية طريقة استخراج الحمض النووي بسيطة وسريعة من فيروس نقص المناعة البشرية proviral DNA من الدم الكامل الكشف عنها بواسطة PCR الكمي. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لاستخدامها في الكشف عن علامات وراثية أخرى أو استخدام أساليب التضخيم بديلة.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

أساليب الكشف الروتيني استخدام الجينوم الفيروسي التضخيم مقيدة بعجزهم عن تميز المعدية من جسيمات غير معدية. والغرض من هذه المقالة توفير بروتوكولات مفصلة عن طرق بديلة للمساعدة على تمييز جزيئات نوروفيروس المعدية استخدام ابتمر ملزمة، وتشتت الضوء الديناميكي، ومجهر إلكتروني.

أساليب بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية قفيصه الفيروسية

يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية تقرير بشأن فيروس نقص المناعة البشرية-1 الانصهار عبر التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء القابلة للكشف المجهري التدفق الخلوي أو الأسفار. ويمكن استخدامه لاختبار مثبطات دخول الفيروسية (على وجه التحديد في الخطوة الانصهار) في نظم خالية من خلية وخلية إلى الإصابة.

Cre-لوكس الفائق تنشيط الإنزيم الانصهار الغشاء الفيروسي التعرف على مثبطات للانصهار الغشاء الفيروسي فيروس نقص المناعة البشرية-1

هنا نقوم بوصف الترسيب المناعي Rev في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لقياس الطيف الكتلي. ويمكن استخدام الأساليب الموصوفة لتحديد العوامل النووية التي تنطوي عليها الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1، وهي تنطبق على نماذج الأمراض الأخرى لتوصيف المسارات التي لم تدرس بعد.

تحديد العوامل النيوكليولار أثناء النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال الترسيب المناعي القس والقياس الطيفي الكتلي

هنا، نقدم بروتوكولا للكشف عن إزالة الأسطح المحايدة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تعرض المستضدات (VLPs). يتم إجراء التكاثر المناعي لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) المشتقة من VLPs باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالجظرات المظروفة إلى جانب الخرز المغناطيسي المقترن بالبروتين G. يتم إخضاع VLPs الملتقطة في وقت لاحق إلى SDS-PAGE والتحليل الغربي لللطخة باستخدام الأجسام المضادة للبروتين الأساسي الفيروسي Gag-specific.

الكشف عن Epitopes الحساسة للتحييد في المستضدات المعروضة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP) المستندة إلى اللقاحات باستخدام م المقايسة التقاط

تقدم هذه المقالة طريقة مبسطة لإعداد 4 مستضد لوحدات تضخم الدم للاختبار المصلي لفيروس مرض نيوكاسل. من خلال التحديد الدقيق لعيار التخثر الدموي للمستضد ، جنبا إلى جنب مع طريقة المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي الأكثر صرامة ، وعملية ضبط محددة جيدا ، فإنه يعزز كفاءة الاختبار ، ويقلل من الإيجابيات الكاذبة ، ويحسن مراقبة الأمراض في الدواجن.

تحسين تحضير المستضد لمقايسة تثبيط التخثر الدموي لعلم مصل فيروس مرض نيوكاسل

اكتشف تقنية قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي لتحديد مثبطات بروتين HIV-1 NC بسرعة. تستخدم هذه الطريقة تسلسلات RNA محددة والتحليل بالتكهرب الكهربائي دون الحاجة للتسميع الإشعاعي.

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

استكشف المزيد من الفيديوهات