التجميع الذاتي من الأشكال ثنائية الأبعاد المعقدة من البلاط DNA المفرد الذين تقطعت بهم السبل

الهدف العام من التجربة التالية هو تكوين هياكل نانوية معقدة للحمض النووي مع بلاط مفرد مجدول. يتم تحقيق ذلك عن طريق خلط خيوط الحمض النووي الاصطناعية المصممة بعناية في المحلول العازل المطلوب لتشكيل البنية النانوية للحمض النووي المطلوبة كخطوة ثانية. العينة عبارة عن ركوع يتم خلالها التجميع الذاتي للهيكل.

بعد ذلك ، يتم إجراء الرحلان الكهربائي للهلام الزراعي الأصلي والتصوير المجهري للقوة الذرية من أجل التحقق من التكوين الناجح للهياكل النانوية. تظهر النتائج أن الهياكل النانوية للحمض النووي مجمعة ذاتيا بناء على الزراعة الأصلية ، والرحلان الكهربائي للهلام والتصوير المجهري للقوة الذرية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تحضير العينة لمثل هذا التجميع الذاتي بدا معقدا قبل البدء في هذا الإجراء ، تم الحصول على خيوط مكون الحمض النووي من تسلسلات محددة مذابة في RNAs ، والماء الحر من الشركة المصنعة للقليل النوكليوتيدات في Vbo 96 ، ماصة ميكرولتر واحد من كل من 362 بئرا ل 24 حلزونية بمقدار 28 دورة.

يضاف المستطيل 100 ميكرومولار لكل خصلة في أنبوب اختبار سعة ملليلتر. ثم أضف 138 ميكرولترا من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب الاختبار لعمل محلول مخزون. بتركيز 200 نانو مولار لكل حبل.

أضف 50 ميكرولترا من محلول مخزون 200 أنو. 10 ميكرولتر من 10 × عازلة التلدين A و 40 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مل. بعد ذلك ، عينة لمدة 17 ساعة في دورة حرارية تبرد من 90 إلى 25 درجة مئوية.

بعد تحضير جل أجروسي أصلي بنسبة 2٪ ملطخ بخزنة SYBR ، قم بتشغيله لمدة ساعتين عند 100 فولت في حمام ماء مثلج. عند الانتهاء ، قم بتصوير الجل باستخدام ماسح ضوئي جل مع مرشح مناسب للبقعة الآمنة SYBR على الضوء الأزرق ، يقوم Transluminator باستئصال النطاق المهيمن بقدرة مماثلة على الحركة مع النطاق المكون من 1 ، 500 زوج أساسي من سلم Kilobase DNA باستخدام شفرة حلاقة نظيفة حادة. ضع قطع الجل المرغوبة في عمود دوران ثم سحق الجل إلى قطع دقيقة باستخدام أنبوب صغير Pele ثم جهاز طرد مركزي عند 438 جم لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية عند 260 نانومتر. في هذه المرحلة ، قم بتقشير MICA المتصل بعينة من القرص المعدني باستخدام شريط سكوتش للحصول على سطح مستو ووضع قرص عينة على مرحلة التصوير بالمجهر.

أضف 40 ميكرولترا من x واحد وعازلة الركوع A متبوعا بخمسة ميكرولترات من العينة المنقاة من 24 HELOCs بمقدار 28 دورة مستطيل إلى سطح الميكا المشقوق حديثا. دع الخليط يستقر لمدة دقيقتين تقريبا. قم بتثبيت شريحة ناتئ نتريت السيليكون A FM على حامل ناتئ ، وصورة العينة في وضع التنصت على السوائل باستخدام حجم مسح ضوئي يبلغ خطين ميكرومتريين 1024 للدقة.

ومعدل مسح من 0.5 إلى هرتز واحد للوسم الداخلي المتصل بثلاثة أجزاء أولية من 17 نيوكليوتيدات إلى ثمانية مربعات داخلية وستة بلاطات حدودية للمستطيل. امزج الخيوط ال 28 بمقابض مع بقية الخيوط المكونة ل 24 HELOCs بمقدار 28 دورة مستطيل لعمل محلول مخزون 200 نانومولار لوضع العلامات على الحدود. امزج الخيوط ال 14 بمقابض مع بقية الخيوط المكونة للبحار ذات 24 كعبا بمقدار 28 دورة مستطيلا للحصول على محلول مخزون 200 نانومولار لوضع العلامات الداخلية.

لوضع العلامات على الحدود ، أضف 50 ميكرولترا من محلول مخزون 200 نانومولار. 60 ميكرولتر من خيوط مضادة للمقبض المعدلة ب 100 ميكرومولار. 10 ميكرولترات من 10 × عازلة التلدين A و 34 ميكرولترا من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب اختبار PCR.

لوضع العلامات الداخلية ، أضف 50 ميكرولترا من محلول مخزون 200 نانومولار. ثلاثة ميكرولترات من خيط البيوتين الداخلي المضاد للمقبض عند 100 ميكرومولار. 10 ميكرولتر من 10 × عازلة التلدين A و 37 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب اختبار PCR.

بعد ذلك ، تزن 0.06 جرام من فورمات المبولة في ثلاثة ملليلتر من الماء المقطر. لتحضير محلول صبغة فورمات المبولة المائي بنسبة 2٪ ، قم بتصفية محلول البقع باستخدام مرشح 0.2 ميكرولتر متصل بالمحقنة. أضف خمسة ميكرولترات من خمسة هيدروكسيد الصوديوم العادي إلى مليلتر واحد من محلول البقع المصفى.

بعد دوامة محلول الطرد المركزي لفترة وجيزة عند توهج 20 ، 000 G. قم بتفريغ الشبكات المطلية بالكربون بحيث يكون الجانب المطلي متجها لأعلى باستخدام الإعدادات التالية عند الانتهاء، قم بتفريغ 3.5 ميكرولتر من العينة على الشبكة المعالجة بتفريغ التوهج. بعد أربع دقائق ، استخدم قطعة من ورق الترشيح لإزالة العينة عن طريق ملامسة ورق الترشيح للشبكة من الجانب.

بعد ذلك ، أضف على الفور 3.5 ميكرولتر من محلول البقعة على الشبكة. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة البقعة وأمسك ورق الترشيح على الشبكة لمدة دقيقة إلى دقيقتين. انقل الشبكة إلى حامل عينة TEM.

صورة باستخدام A-J-E-O-L GM 1400 ، تعمل بجهد 80 كيلو فولت مع تكبير يتراوح من 10 كلفن إلى 80 كلفن ، بمجرد تحديد الشكل ، حدد الخيوط التي تتوافق مع الشكل الموجود على القماش الجزيئي. استبدل المجال المكشوف بمقطع بولي تي ، بطول 10 إلى 11 نيوكليوتيد ، أو أضف واقي حافة مكمل للمجال المكشوف وقم بإنهائه بقطعة بولي T طويلة من 10 إلى 11 نيوكليوتيدات. لمنع التجميع ، قم بإنشاء مكتبة خيوط لللوحة الجزيئية 310 بكسل ، والتي تتضمن المشد.

قم بتعيين نجمة واحدة مجموعة نجمتين وثلاث نجوم ومجموعة أربع نجوم لإعطاء ما مجموعه 1 ، 344 واقيا للحافة. بعد الطرد المركزي لألواح الآبار البالغ عددها 96 لمجموعات مختلفة ، قم بعمل ماصة ميكرولتر واحد من 206 خيوط من المجموعة الأساسية ، وصفر من مجموعة نجمة واحدة من المجموعة ، ونجمتان صفرا من المجموعة ، وثلاثة نجوم و 24 خيطا من مجموعة أربع نجوم في أنبوب طرد مركزي سعة ملليلتر. أضف 20 ميكرولترا من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى الأنبوب لعمل محلول مخزون 400 نانومولار من خيوط الحمض النووي.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من محلول مخزون 400 نانومولار. 10 ميكرولتر من 10 × عازلة التلدين B و 40 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مليلتر والخليط في جهاز التدوير الحراري لمدة 17 ساعة كما هو موضح سابقا. بعد تنقية العينة وقياس صورة تركيز الحمض النووي ، تقوم العينة باستخدام FM بنفس الطريقة كما كانت من قبل أربعة أخيرا ببناء مستطيلات مختلفة الحجم ببساطة عن طريق تغيير عدد heoc المتوازي وعدد المنعطفات الحلزونية.

سينتج عن التجميع الذاتي للبلاط أحادي الجداول 24 HELOCs بمقدار 28 دورة ، ويمكن تعديل تسلسل الحمض النووي المستطيل لمختلف البلاط الفردي الذي تقطعت به السبل وتحسينه لتمكين تقسيم البكتيريا العقدية ووضع العلامات على تحويل المستطيل إلى أنبوب. تم اختبار التجميع الذاتي القابل للبرمجة للبلاط المفرد الذي تقطعت به السبل لتشكيل أنابيب ومستطيلات بأحجام مختلفة وبناء أشكال تعسفية ثنائية الأبعاد باستخدام تصميم استبدال المجال للقماش الجزيئي وتصميم واقي الحافة كحلول للتجميع على طول المجالات المكشوفة ذات الأشكال التعسفية. كلا التصميمين لهما إنتاجية هلامية مماثلة وسلامة هيكلية ، لكن تصميم واقي الحافة أكثر فعالية من حيث التكلفة لأنه يتطلب عددا أقل من الأنواع المساعدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء هياكل نانوية معقدة للحمض النووي تعتمد على بلاط حبلا واحد.