التجميع الذاتي من الأشكال ثنائية الأبعاد المعقدة من البلاط DNA المفرد الذين تقطعت بهم السبل

الهدف العام من التجربة التالية هو تشكيل بنى نانوية معقدة من الـ DNA باستخدام بلاطات من خيوط DNA أحادية السلسلة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق خلط خيوط DNA اصطناعية مصممة بعناية في محلول منظم محدد لتشكيل البنية النانوية المطلوبة من الـ DNA كخطوة ثانية. يتم بعدها تبريد العينة تدريجياً، وهي المرحلة التي يتم فيها التجميع الذاتي للبنية.

بعد ذلك، يتم إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز الأصلي والتصوير بالمجهر القوة الذرية للتحقق من نجاح تكوين البنى النانوية. وتظهر النتائج تجميعًا ذاتيًا للبنى النانوية للحمض النووي (DNA) استنادًا إلى الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز الأصلي والتصوير بالمجهر القوة الذرية. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن تحضير عينات هذا التجميع الذاتي يبدو معقدًا. قبل البدء في هذا الإجراء، يتم الحصول على خيوط مكونات DNA ذات تسلسلات محددة مذابة في مياه خالية من RNase من مصنع أوليغونوكليوتيد في أطباق Vbo ذات 96 بئرًا، ثم يتم سحب 1 µL من كل بئر من الآبار 362 الخاصة بـ 24 لولبًا و28 دورة.

أضف 100 micromolar لكل شريط إلى أنبوب اختبار سعة two milliliter. ثم أضف 138 microliters من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب الاختبار لتحضير محلول مخزون بتركيز 200 nano molar لكل شريط.

أضف 50 µL من المحلول المخزون بتركيز 200 nM، و 10 µL من منظم التلدين A بتركيز 10x، و 40 µL من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب PCR سعة 0.2 mL. بعد ذلك، قم بتلدين العينة لمدة 17 ساعة في جهاز التدوير الحراري مع التبريد من 90 إلى 25 °C.

بعد تحضير هلام agarose بنسبة 2% طبيعي مسبق الصبغ بـ SYBR safe، يتم تشغيله لمدة ساعتين بجهد 100 volts في حمام مائي مثلج. عند الانتهاء، يتم تصوير الهلام باستخدام ماسح ضوئي للهلام مع مرشح مناسب لصبغة SYBR safe على جهاز Transluminator ذو ضوء أزرق، ثم تُقطع الحزمة السائدة ذات الحركية المماثلة لحزمة 1,500 base pairs من سلم DNA بسعة one Kilobase باستخدام شفرة حلاقة حادة ونظيفة. توضع قطع الهلام المطلوبة في عمود طرد مركزي (spin column)، ثم يتم سحق الهلام إلى قطع صغيرة باستخدام Pestle لأنبوب دقيق، وبعد ذلك يتم إجراء الطرد المركزي عند 438 G لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بقياس تركيز DNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية عند 260 نانومتر. وفي هذه المرحلة، قم بإزالة رقاقة MICA الملتصقة بالقرص المعدني للعينة باستخدام شريط لاصق للحصول على سطح مستوٍ، ثم ضع قرص العينة على منصة التصوير الخاصة بالمجهر.

أضف 40 µL من المنظم A بتركيز 1x ثم أضف 5 µL من العينة المنقاة من 24 HELOCs بـ 28 دورة مستطيلة إلى سطح الميكا المقطوع حديثاً. اترك الخليط ليستقر لمدة دقيقتين تقريباً. قم بتركيب شريحة عارضة من نيتريد السيليكون AFM على حامل العوارض، ثم صوّر العينة في وضع النقر السائل (fluid tapping mode) باستخدام حجم مسح قدره 2 µm وبدقة تصل إلى 1024 خطاً.

ومعدل مسح يتراوح من 0.5 إلى 1 هرتز للوسم الداخلي المرتبط بقطعة مكونة من 17 نيوكليوتيد عند الطرف '3 لثماني بلاطات داخلية وست بلاطات حدودية للمستطيل. اخلط الـ 28 شريطاً ذات المقابض مع بقية الشرائط المكونة لـ 24 HELOCs في مستطيل مكون من 28 لفة لتحضير محلول مخزون بتركيز 200 NANOMOLAR للوسم الحدودي. اخلط الـ 14 شريطاً ذات المقابض مع بقية الشرائط المكونة لـ 24 heel seas في مستطيل مكون من 28 لفة للحصول على محلول مخزون بتركيز 200 Nanomolar للوسم الداخلي.

لأجل وسم الحدود، أضف 50 µL من المحلول المخزون بتركيز 200 nM، و60 µL من خيوط المقبض المضادة المعدلة بالبيوتين بتركيز 100 µM، و10 µL من منظم التلدين A بتركيز 10x، و34 µL من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب اختبار PCR.

لأغراض الوسم الداخلي، أضف 50 µL من المحلول المخزون بتركيز 200 nM، و3 µL من شريط anti handle biotin المعدل داخلياً بتركيز 100 µM، و10 µL من محلول التلدين A بتركيز 10x، و37 µL من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب اختبار PCR.

بعد ذلك، قم بوزن 0.06 grams من فورمات اليورينال في ثلاثة milliliters من الماء المقطر. ولتحضير محلول صبغة فورمات اليورينال المائية بتركيز 2%، قم بترشيح محلول الصبغة باستخدام مرشح 0.2 microliter متصل بمحقنة. أضف خمس microliters من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 5 normal إلى واحد milliliter من محلول الصبغة المُرشح.

بعد رج المحلول لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortex، يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 20,000 G. يتم تفريغ الشحنة الكهربائية (glow discharge) للشبكات المطلية بالكربون بحيث يكون الجانب المطلي متجهًا للأعلى باستخدام الإعدادات التالية. عند الانتهاء، يتم نقل 3.5 µL من العينة بواسطة الماصة إلى الشبكة المعالجة بتفريغ الشحنة. وبعد مرور أربع دقائق، تُستخدم قطعة من ورق الترشيح لسحب العينة عن طريق ملامسة ورق الترشيح للشبكة من الجانب.

أضف مباشرة بعد ذلك 3.5 µL من محلول الصبغ على الشبكة. وبعد دقيقة واحدة، قم بسحب الصبغ الزائد باستخدام ورقة ترشيح مع تثبيتها مقابل الشبكة لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ثم انقل الشبكة إلى حامل عينات TEM.

صورة باستخدام A-J-E-O-L GM 1400، تم تشغيله عند 80 kilovolts بتكبير يتراوح من 10 K إلى 80 K. بمجرد تحديد الشكل، اختر السلاسل التي تتوافق مع الشكل على اللوحة الجزيئية. استبدل النطاق المكشوف بقطعة poly T، يتراوح طولها من 10 إلى 11 nucleotides، أو أضف واقياً للحواف يكون مكملاً للنطاق المكشوف وانهِهِ بقطعة poly T يتراوح طولها من 10 إلى 11 nucleotide. ولمنع التجميع، أنشئ مكتبة سلاسل للوحة الجزيئية ذات 310 pixel، والتي تتضمن المشد.

قم بتجهيز المجموعة الأولى ذات النجمة الواحدة، والمجموعة الثانية ذات النجمتين، والمجموعة الثالثة ذات الثلاث نجمات، والمجموعة الرابعة ذات الأربع نجمات للحصول على إجمالي 1,344 من واقيات الحواف. بعد طرد صفائح 96 بئراً للمجموعات المختلفة مركزياً، انقل بواسطة الماصة 1 µL من 206 خيطاً من المجموعة الأساسية، وصفر من المجموعة الأولى ذات النجمة الواحدة، وصفر من المجموعة الثانية ذات النجمتين، وصفر من المجموعة الثالثة ذات الثلاث نجمات، و 24 خيطاً من المجموعة الرابعة ذات الأربع نجمات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 mL. أضف 20 µL من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى الأنبوب لتحضير محلول مخزون بتركيز 400 nM من خيوط DNA.

بعد ذلك، أضف 50 µL من المحلول المخزني بتركيز 400 nM، و10 µL من منظم التلدين B بتركيز 10x، و40 µL من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب PCR سعة 0.2 mL، ثم قم بتلدين الخليط في الجهاز الدوري الحراري لمدة 17 ساعة كما وصف سابقاً. وبعد تنقية العينة وقياس تركيز DNA، يتم تصوير العينة باستخدام FM بنفس الطريقة السابقة، وفي النهاية يتم بناء مستطيلات بأحجام مختلفة عن طريق تغيير عدد اللوالب المتوازية وعدد اللفات الحلزونية ببساطة.

سيؤدي التجميع الذاتي للبلاطات أحادية السلسلة إلى إنتاج مستطيل بأبعاد 24 HELOCs في 28 دورة، ويمكن تعديل وتحسين تسلسلات DNA للبلاطات أحادية السلسلة المختلفة لتمكين الفصل والوسم بـ strep، وتحويل المستطيل إلى أنبوب. تم اختبار التجميع الذاتي القابل للبرمجة للبلاطات أحادية السلسلة لتشكيل أنابيب ومستطيلات بأحجام متفاوتة، وبناء أشكال تعسفية ثنائية الأبعاد باستخدام لوحة الرسم الجزيئية، واختبار تصميم استبدال النطاق وتصميم واقي الحافة كحلول للتجمع على طول النطاقات المكشوفة للأشكال التعسفية. يتمتع كلا التصميمين بمردود هلامي وسلامة هيكلية متقاربة، إلا أن تصميم واقي الحافة أكثر فعالية من حيث التكلفة لأنه يتطلب أنواعاً مساعدة أقل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع هياكل نانوية معقدة من DNA بناءً على بلاطات من خيط واحد.