استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مثيلة CPG في المناطق المستهدفة ذات الأهمية خارج الحمض النووي الجيني ، المعزولة عن الأنسجة أو الخلايا ذات الأهمية. يتم تحقيق ذلك من خلال التصميم الأول بواسطة بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة بالكبريتيت لتضخيم المناطق ذات الأهمية من الحمض النووي الجيني المحول للكبريتيت الثنائي. في الخطوة الثانية ، يتم تضخيم منطقة الاهتمام المحولة بالكبريتيت الثنائي ، ويتم إنشاء تسلسل الجيل التالي أو مكتبات NGS من سلبيات Amplicons.

بعد ذلك ، يتم تسلسل المكتبات ويتم إنشاء ملفات FASTQ للتحليل. في الخطوة الأخيرة ، تتم محاذاة قراءات التسلسل مع التسلسل المستهدف المرجعي المحول من ثنائي الكبريتيت ، ويتم حساب النسبة المئوية الخمسة mc في النهاية عن طريق تسلسل أمبليكون الكبريتيت أو BS a s يمكن إجراؤها لتحديد مثيلة CPG بدقة ودقة في أي منطقة ذات أهمية من أي كائن حي نموذجي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تسلسل سانجر ، هي أن BS A S يوفر كمية مثيلة CPG دقيقة ودقيقة بطريقة إنتاجية عالية سريعة ، مما يوفر الفرصة لفحص مناطق متعددة في عدد كبير من العينات.

بعد تحديد الهدف وتصميم التمهيدي ، قم بتجميع التفاعل لتحسين تضخيم الهدف لمضخم واحد ، ثم قم بإغلاق لوحة PCR بغشاء محكم الغلق حراريا لتصور الأمبليكونات عن طريق الرحلان الكهربائي للصفحة. بعد ذلك ، قم بتحميل الآبار المناسبة ب 30 ميكرولتر من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل أو السلم ، ثم قم بتشغيل الجل عند 200 فولت لمدة 45 دقيقة تقريبا. عندما تصل الصبغة الأولى إلى نهاية الجل ، أوقف التفاعل ثم قم بتغطية الجل بالكامل بخمسة ميكروغرامات لكل ملليلتر من بروميد AUM المحضر حديثا.

بعد خمس دقائق ، قم بتصوير الجل عبر محول الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي إثارة يبلغ 482 نانومتر. استخدم السلم لقياس حجم أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد خصوصية التفاعل. ابحث عن نطاقات متعددة بخلاف حجم الamplicon المتوقع لتحديد متوسط حجم قمم المكتبة المكتشفة وتقدير المولارية.

بعد ذلك ، قم بتشغيل المكتبات على شريحة تحجيم الحمض النووي للرحلان الكهربائي الشعري مع مقايسة الحمض النووي عالية الحساسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتحديد المكتبات حسب QPCR. استخدم الاشعال المصممة مقابل تسلسلات المحول في المكتبات والمعايير التي تم إنشاؤها بتركيز معروف على أداة في الوقت الفعلي ، باستخدام إعدادات القياس الكمي المطلقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

ثم استخدم حجم المكتبات والكمية المولية من QPCR لحساب التركيزات المولية للمكتبات. بعد التسلسل، قم باستيراد ملفات Q السريعة المضغوطة إلى مسار تحليل التسلسل المناسب، وحدد استيراد، ثم حدد طريقة التسلسل المستخدمة لإنشاء القراءات للاحتفاظ بدرجات Q لتطبيقات اقتطاع القراءة. قم باستيراد ملفات القراءة السريعة Q المضغوطة المناسبة، ثم ضمن الخيارات العامة، قم بإلغاء تحديد تجاهل درجات الجودة.

حدد موقعا للقراءات المستوردة وانقر فوق إنهاء. ثم ضمن أدوات NGS الأساسية ، حدد تسلسلات القص. قم بتمييز القراءات المراد اقتطاعها، مع الاحتفاظ فقط بالقراءات التي تحتوي على درجات أكبر من أو تساوي درجات Q 30.

ثم حدد القطع باستخدام درجات الجودة واضبط الحد على 0.001. لتحديد القصب فقط الذي يحتوي على أقل من أو يساوي نيوكليوتيد غامض واحد. حدد قص النيوكليوتيدات الغامضة وقم بتعيين الحد الأقصى لعدد الغموض على واحد.

ثم حدد موقعا لحفظ القراءات المقتطعة وانقر فوق إنهاء لتعيين الدقة المقتطعة إلى السيليكو بواسطة مرجع الجينات المحول للكبريتيت. ضمن أدوات NGS الأساسية، حدد قراءات الخريطة. للرجوع إليها، حدد القراءات المقتطعة المراد تعيينها وانقر فوق التالي.

ثم ضمن إخفاء المرجع ، حدد التسلسل المرجعي المحول وحدد عدم وجود إخفاء. انقر فوق التالي ثم قم بتعيين درجة ثلاثة لحالات عدم التطابق والإدراج والحذف. قم بتعيين درجة واحدة للجزء الأدنى من خريطة طول القراءة للمرجع وقم بتعيين درجة 0.9 للحد الأدنى لكسر الهوية بين الخريطة والقراءة والمرجع ضمن معالجة المطابقة غير المحددة، وحدد وتجاهل وانقر فوق التالي ضمن خيارات الإخراج.

بعد ذلك، حدد إنشاء تعيينات قراءة مستقلة. ثم ضمن معالجة النتيجة، انقر فوق حفظ. حدد موقعا لحفظ تعيين القراءة وانقر فوق إنهاء لتشغيل استدعاء المتغير على القراءات المعينة.

ضمن تحليل إعادة التسلسل ، حدد اكتشاف متغير التردد المنخفض واختر تعيين القراءة المراد تحليله. انقر فوق التالي ثم ضمن معلمة متغير التردد المنخفض ، أدخل 0.01٪ وانقر فوق التالي. ضمن عوامل التصفية العامة ، اضبط الحد الأدنى للتغطية على 1000 للتأكد من أن التسلسل على عمق أكبر من أو يساوي 1000 x.

أخيرا ، انقر فوق التالي ، ثم ضمن خيارات الإخراج ، حدد إنشاء جدول مشروحة وحدد موقعا لحفظ ملف الجدول المتغير ، وانقر فوق إنهاء واستخدم الترددات المتغيرة في مواقع CPG المشروحة في منطقة الاهتمام من ملف الجدول المتغير لحساب تردد مثيلة السيتوزين في السيتوزين المرجعي في سياق CG عن طريق تسلسل أمبليكون الكبريتيت المحاذاة بشكل صحيح للتسلسل المرجعي المحول ستشبه تلك الموضحة في الشكل. يمكن تحديد ثنائي النوكليوتيدات CPG بوضوح ويمكن تقدير حالات المثيلة من خلال مراقبة النداءات الأساسية في مواقع CPG. في القراءات المعينة ، ستؤدي المثيلة بنسبة 0٪ إلى قراءات معينة تحتوي على الثايمين المعينة لمواقع CPG.

ستؤدي ضوابط المثيلة بنسبة 100٪ إلى قراءات معينة تحتوي على السيتوزين المعينة لمواقع CPG. في هذه التجربة ، تم عزل الحمض النووي الريبي والحمض النووي بشكل مشترك من الفأر والمخيخ والشبكية. ثم تم قياس تعبير opsin المعبر عنه بشكل انتقائي في أنسجة الشبكية باستخدام QPCR كما هو متوقع.

تم اكتشاف الحمض النووي الريبي opsin فقط في شبكية العين بعد القياس الكمي لمستويات مثيلة CPG في منطقة محفز Opsin عن طريق تسلسل تضخيم الكبريتات الثنائية. ومع ذلك ، كانت مستويات المثيلة التراكمية عبر منطقة المروج أكبر من 80٪ في المخيخ مقارنة بأقل من 15٪ في شبكية العين. يستفيد الكمي لمثيلة B SAS من القياس الكمي للمثيلة الخاصة بالموقع ، مما يسمح بمقارنة مستويات المثيلة على أساس CPG محدد عبر أي منطقة جينومية معينة.

في الواقع ، في هذه التجربة ، وجد أن مستويات مثيلة CPG عبر محفز opsin أعلى بكثير في عينات المخيخ عند مقارنتها بعينات شبكية العين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد مثيلة CPG في المناطق المستهدفة ذات الأهمية من الحمض النووي الجيني ، المعزولة عن الأنسجة أو الخلايا.