استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس ميثيلة CPG كمياً في مناطق مستهدفة ذات أهمية ضمن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA)، والمعزول من أنسجة أو خلايا معينة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تصميم بادئات PCR متخصصة في الكبريتيت لتضخيم المناطق ذات الأهمية من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المحول بالبيسلفيت. وفي الخطوة الثانية، يتم تضخيم المنطقة ذات الأهمية المحولة بالبيسلفيت، ومن ثم إنشاء مكتبات تسلسل الجيل التالي (NGS) من نواتج التضخيم.

بعد ذلك، يتم تسلسل المكتبات وإنشاء ملفات FASTQ لتحليلها. وفي الخطوة النهائية، يتم محاذاة قراءات التسلسل مع التسلسل المرجعي المستهدف المحول بالبيسلفيت، ويتم حساب نسبة الـ 5-mc في النهاية عن طريق تسلسل الأمبليكون بالبيسلفيت أو يمكن إجراء BS a s لتقدير كمية مثيلة CPG بدقة وإحكام في أي منطقة ذات أهمية من أي كائن نموذجي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تسلسل سانجر، هي أن BS A S توفر تقديرًا كميًا دقيقًا ومحكماً لمثيلة CPG بطريقة سريعة وعالية الإنتاجية، مما يتيح الفرصة لفحص مناطق متعددة في عدد كبير من العينات.

بعد تحديد الهدف وتصميم البادئ، قم بتجهيز التفاعل لتحسين تضخيم الهدف لقطعة تضخيم واحدة، ثم أغلق صفيحة PCR بغشاء إغلاق حراري لتصور قطع التضخيم بواسطة الفصل الكهربائي للهلام. بعد ذلك، قم بتعبئة الآبار المناسبة بـ 30 µL من تفاعلات PCR أو السلم الجزيئي، ثم قم بتشغيل الهلام عند 200 فولت لمدة 45 دقيقة تقريبًا. عندما تصل الصبغة الأولى إلى نهاية الهلام، أوقف التفاعل ثم غطِّ الهلام بالكامل بـ 5 µg/mL من بروميد AUM المُحضّر حديثًا.

بعد مرور خمس دقائق، قم بتصوير الهلام باستخدام جهاز ترانسلوميناتور (UV transluminator) عند طول موجي للإثارة يبلغ 482 نانومتر. استخدم السلم الجزيئي لتحديد حجم نواتج تضخيم PCR (PCR AMPLICONS) لتعيين خصوصية التفاعل. ابحث عن وجود نطاقات متعددة بخلاف حجم الناتجمتوقع لتحديد متوسط حجم قمم المكتبة المكتشفة وتقدير المولارية.

بعد ذلك، قم بتشغيل المكتبات على شريحة قياس حجم DNA عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري باستخدام مقايسة DNA عالية الحساسية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ولتقدير كمية المكتبات بواسطة QPCR، استخدم بادئات مصممة ضد تسلسلات المهايئ في المكتبات التي تم إنتاجها ومعايير ذات تركيز معروف على جهاز الوقت الحقيقي، مع استخدام إعدادات التحديد الكمي المطلق وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

بعد ذلك، استخدم حجم المكتبات والتقدير المولي من QPCR لحساب التركيزات المولية للمكتبات. وبعد التسلسل، استورد ملفات fast Q المضغوطة في مسار تحليل التسلسل المناسب، واختر "import"، ثم حدد طريقة التسلسل المستخدمة لإنتاج القراءات للحفاظ على درجات Q الخاصة بتطبيقات تقليم القراءات. استورد ملفات قراءات fast Q المضغوطة المناسبة، ثم من الخيارات العامة، قم بإلغاء تحديد "discard quality scores".

حدد موقعاً للقراءات المستوردة وانقر على إنهاء. ثم من أدوات NGS الأساسية، اختر تقليم التسلسلات (trim sequences). حدد القراءات المراد تقليمها، مع الاحتفاظ فقط بالقراءات التي تحتوي على درجات جودة Q 30 أو أعلى.

بعد ذلك، اختر التشذيب باستخدام درجات الجودة واضبط الحد على 0.001. ولاختيار القراءات التي تحتوي على واحد أو أقل من النوكليوتيدات الغامضة فقط، اختر تشذيب النوكليوتيدات الغامضة واضبط الحد الأقصى لعدد الغموض على واحد.

ثم حدد موقعًا لحفظ القراءات المقصوصة وانقر على إنهاء لمطابقة القراءات المقصوصة مع المرجع الجيني المحول في السيليكون بواسطة السلفيت. من أدوات NGS الأساسية، اختر مطابقة القراءات. وفي خانة المرجع، حدد القراءات المقصوصة المراد مطابقتها وانقر على التالي.

بعد ذلك، من قائمة "قناع المرجع" (reference masking)، اختر تسلسل المرجع المحول ثم حدد "بلا قناع" (no masking). انقر فوق "التالي" (next)، ثم خصص درجة ثلاثة لحالات عدم التطابق والإدراجات والحذف. خصص درجة واحد للحد الأدنى من كسر طول القراءة المطابق للمرجع، وخصص درجة 0.9 للحد الأدنى من كسر التطابق بين الخريطة والقراءة والمرجع. تحت قائمة "معالجة التطابق غير المحدد" (nonspecific match handling)، اختر "تجاهل" (ignore)، ثم انقر فوق "التالي" (Next) ضمن خيارات المخرج (output options).

بعد ذلك، اختر Create standalone read mappings. ثم تحت result handling، انقر فوق save. حدد موقعاً لحفظ read mapping، وانقر فوق finish لتشغيل variant calling على read mappings التي تم تعيينها.

ضمن تحليل إعادة التسلسل، حدد خيار الكشف عن المتغيرات منخفضة التردد واختر تخطيط القراءة المراد تحليله. انقر على "التالي"، ثم ضمن معلمات المتغيرات منخفضة التردد، أدخل 0.01% وانقر على "التالي". ضمن المرشحات العامة، اضبط الحد الأدنى للتغطية على 1000 لضمان أن يكون عمق التسلسل أكبر من أو يساوي 1000 x.

أخيراً، انقر فوق "التالي"، ثم اختر "إنشاء جدول مشروح" (create annotated table) من خيارات المخرجات، وحدد موقعاً لحفظ ملف جدول المتغيرات، ثم انقر فوق "إنهاء". استخدم ترددات المتغيرات في مواقع CPG المشروحة في المنطقة المحددة من ملف جدول المتغيرات لحساب تردد مثيلة السيتوزين عند سيتوزين مرجعي في سياق CG؛ حيث ستشبه قراءات تسلسل الأمبليكون بالكبريتيت (sulfite amplicon sequencing reads) التي تمت محاذاتها بشكل صحيح مع التسلسل المرجعي المحول تلك الموضحة في الشكل. يمكن تحديد ثنائيات النوكليوتيدات CPG بوضوح، كما يمكن تقدير حالات المثيلة من خلال ملاحظة استدعاءات القواعد (base calls) في مواقع CPG. في القراءات الممسوحة، ستؤدي نسبة مثيلة 0% إلى ظهور قراءات ممسوحة تحتوي على الثايمين عند مواقع CPG.

ستؤدي ضوابط الميثيلية بنسبة 100% إلى الحصول على قراءات مُصنفة تحتوي على سيتوزينات مُسندة إلى مواقع CPG. وفي هذه التجربة، تم عزل RNA وDNA معاً من مخيخ وشبكية فأر. ثم تم قياس تعبير الأوبسين، الذي يتم التعبير عنه بشكل انتقائي في أنسجة الشبكية، باستخدام QPCR كما كان متوقعاً.

تم اكتشاف الحمض النووي الرايبوزي (RNA) للأوبسين في الشبكية فقط بعد تقدير مستويات مثيلة CPG في منطقة محفز الأوبسين عن طريق تسلسل تضخيم البيسلفيت. ومع ذلك، كانت مستويات المثيلة التراكمية عبر منطقة المحفز أكبر من 80% في المخيخ مقارنة بأقل من 15% في الشبكية. يستفيد التقدير الكمي للمثيلة بواسطة B SAS من التقدير الكمي للمثيلة في مواقع محددة، مما يسمح بمقارنة مستويات المثيلة على أساس CPG محدد عبر أي منطقة جينية معينة.

في الواقع، تبين في هذه التجربة أن مستويات مثيلة CPG عبر محفز الأوبسين كانت أعلى بشكل ملحوظ في عينات المخيخ مقارنة بعينات الشبكية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس كمية مثيلة CPG في مناطق محددة ذات أهمية من الحمض النووي الجينومي، المستخلص من الأنسجة أو الخلايا.