فائقة الدقة التصوير من الخلايا القاتلة الطبيعية المناعية المشبك على دعم الزجاج مستو الدهن طبقة ثنائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية التقاط صور فائقة الدقة بنجاح للمشابك المناعية للخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا القاتلة الطبيعية على طبقة الدهون الثنائية المدعومة. يتم تحقيق ذلك عن طريق بناء طبقة ثنائية دهنية مستوية مدعومة بالزجاج تحتوي على أجسام مضادة ضد مستقبلات تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية CD 16 في شرائح الغرفة. ثم تضاف الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة مسبقا إلى الطبقة الدهنية الثنائية المضمنة في الجسم المضاد المستوي ، متبوعة بتلوين الخلايا بالأكتين والبيرفورين.

الخطوة الأخيرة هي تصوير نقاط الاشتباك العصبي للخلايا القاتلة الطبيعية الناتجة باستخدام المجهر الثابت ، وفي النهاية تصوير مشبك NK على طبقة الدهون الثنائية المدعومة. يظهر استخدام stead مشبك الخلية NK بتفاصيل محسنة ، مما يسمح بتصور البنية الفائقة للهيكل الخلوي للأكتين وحبيبات بيران الإيجابية الموضوعة فوق مناطق ذات كثافة منخفضة من الأكتين F. لذا فإن العنصر الرئيسي لهذه التقنية هو أن حاجز الدهون العادي الداعم الزجاجي يمكن أن يحاكي الغشاء الزائد لخلية الثنية ، وهو البروتين الموجود على حاجز الدهون العادي هذا.

هم يستطيع تحركت جانبيا, أي يستطيع على نحو أفضل يلخص من تشكيل من جدا منطقيا ذات صلة من مشبك مناعي. يمكن أن تساعد هذه الرسالة في الإجابة على المسيحيين الرئيسيين في مجال علم المناعة ، مما يسمح للمحققين بتصور تكوين المشبك بطريقة التحكم بالتفصيل ، وهو أمر لا يمكن تحقيقه باستخدام الأساليب التجارية والمجهرة. سيوضح زميل ما بعد الدكتوراه ومنحة طلاب الدراسات العليا الإجراء لتجميع طبقة ثنائية الدهون المستوية المدعومة بالزجاج.

أولا ، قم بإعداد 100 مل من محلول سمكة الضاري المفترسة عن طريق خلط 30٪ بيروكسيد الهيدروجين مع حمض الكبريتيك بنسبة واحد إلى ثلاثة في دورق في هذا المحلول. ضع زلاقتين مستطيلتين رقم 1.5 لمدة 20 إلى 30 دقيقة أثناء تنظيف زلات الغطاء. استرجع أنبوبا واحدا من 400 دهون DOPC ميكرومولار المعدة مسبقا وأنبوب واحد من 80 دهون ميكرومولار من البيوتين PE المعدة مسبقا.

انقلها على الجليد إلى خزان الأرجون بعد أكسجة أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بالأرجون. اجمع DOPC والبيوتين PE معا بنسبة واحد إلى واحد. سيختلف الحجم المحدد بناء على الاحتياجات التجريبية ، ولكن يجب أن يكون على الأقل ميكرولتر.

يقوم كل deoxy بالأكسجين في أنبوب الخليط وأنابيب الكاشف الفردية قبل إعادة السلم إلى الثلاجة. بعد الانتهاء من التنظيف جيدا ، اشطف زلات الغطاء بالماء المقطر. اضبط الغطاء على السطح ليجف في الهواء لبضع دقائق ، ثم اسحب 1.5 ميكرولتر من خليط الجسيمات الشحمية وقم بتثبيته في قطرة واحدة في إحدى غرف الممر في شريحة الغرفة.

يعد استخدام قطرتين لكل حارة أمرا نموذجيا ولكنه ليس ضروريا. الآن ، بسرعة وكفاءة ، ضع زلة الغطاء الجاف فوق القطرات ، وتأكد من أن القطرات متباعدة بدرجة كافية حتى لا تندمج بمجرد وضع زلة الغطاء. علاوة على ذلك ، تأكد من أن القطرات تظل دائرية ومحددة جيدا دون لمس حواف جدران الغرفة.

اضغط بقوة بين كل حارة وحولها لضمان إحكام تسرب الماء بين الغطاء. قم بالانزلاق والتمرير وقم بتمييز مواضع القطرات باستخدام قلم تحديد. ثم مرر 100 ميكرولتر من الغلاف المائي بنسبة 5٪ عبر الغرفة لمنع الطبقة الثنائية.

حاول التأكد من عدم وجود فقاعات في غرفة التدفق. ثم حقن 100 ميكرولتر من الستربت أدين بتركيز 333 نانوجرام لكل مليلتر في كل حارة. بعد الحضانة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل عن طريق تشغيل ثلاثة ملليلتر من أكوام المحلول الملحي مع 1٪ من الألبومين البشري في كل حارة.

لإزالة التريتين الزائد ، أضف 100 ميكرولتر من البيوتينيل المضاد للقرص المضغوط 16 المصنف بالفلورسنت بتركيز البروتين المحدد مسبقا كما هو موضح في بروتوكول النص بعد الحضانة في الظلام لمدة 20 إلى 30 دقيقة. اغسل مرة أخرى عن طريق تشغيل ثلاثة ملليلتر من أكوام المحلول الملحي مع 1٪ من ألبومين المصل البشري عبر كل حارة. ثم قم بتدفق 100 ميكرولتر من البيوتين D بتركيز 25 نانومولار عبر الغرفة من أجل ربط أي تابين STR زائد وبالتالي القضاء على فرصة الارتباط غير المحدد لتابين STR بالخلايا.

بعد ذلك ، قم بحساب الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية وإعادة تعليقها بتركيز 500 ، 000 لكل مليلتر في أكوام من محلول ملحي مخزن مع 1٪ من الألبومين البشري. اغسل البيوتين D خارج الغرفة بثلاثة ملليلتر أخرى من أكوام المحلول الملحي المخزنة مع 1٪ من ألبومين المصل البشري لكل حارة. بمجرد إعادة تعليق الخلايا بالتركيز المطلوب ، أضف 100 ميكرولتر إلى كل حارة.

ضع الغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد فترة الحضانة هذه ، قم بإصلاح الخلايا باستخدام 4٪ ألدهيد بارافورم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. اغسل عن طريق تشغيل ثلاثة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات عبر كل حارة لإزالة الألدهيد الطلائلي.

ثم أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب قبل احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتضخيم الأكتين والبيرفورين عن طريق إضافة ميكرولترين من Phin المخفف المسمى بالفلورسنت والأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للبيران المسمى بالفلورسنت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة قبل الغسيل عن طريق تشغيل ثلاثة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات عبر الغرفة. الغرفة جاهزة لبدء التصوير.

قم بتشغيل جميع وحدات الأجهزة الضرورية للمجهر الثابت. ابدأ تشغيل برنامج تحليل الصور وقم بتمكين كل من المسح بالرنين والوحدات النمطية. بعد إجراء هذه التحديدات ، انتظر حوالي ثلاث إلى خمس دقائق حتى يبدأ البرنامج.

انقر فوق علامة تبويب التكوين في الجزء العلوي من الشاشة ، وحدد تكوين الليزر. ثم قم بتشغيل الضوء الأبيض والليزر المكاني 592 نانومتر. اختر الهدف 100 × وقم بمحاذاة شعاع ليزر الإثارة مع ليزر استنفاد 592 نانومتر.

حدد وحدة تكوين الليزر ، وقم بإيقاف تشغيل ليزر النضوب 592 وقم بتشغيل ليزر النضوب 660 نانومتر. ضع الشريحة على المسرح فوق العدسة. اجعل الخلايا المرتبطة بمنطقة الطبقة الثنائية المحددة في التركيز باستخدام مصباح الضوء الأبيض والعينات.

ثم ارجع إلى علامة تبويب الاستحواذ مباشرة على يمين علامة تبويب التكوين. انقر فوق علامة التبويب التبديل إلى الضوء الأبيض ثم قم بتشغيل هذه الوحدة واسحب خط ليزر الإثارة إلى الطول الموجي المناسب. بعد تحديد الكاشف المطلوب وتعيين نطاق الكشف ، انقر فوق الزر المتسلسل في شريط أدوات الحصول على اليد اليسرى لإظهار حوار المسح المتسلسل في الجزء السفلي من شريط الأدوات الأيسر.

يتيح ذلك للمستخدم إضافة تسلسلات متعددة لكل منها شعاع إثارة مختلف للون مختلف. انقر بين الإطارات ثم قم بتعيين كاشف تردد الإثارة ونطاق الكشف لكل لون إضافي. بمجرد تحسين جميع الإعدادات ، اضغط على ابدأ لبدء عملية الاستحواذ.

تظهر الصورة الثلاثية الملونة لمشبك الخلايا القاتلة الطبيعية على طبقة ثنائية دهنية مستوية مدعومة بالزجاج أن الجسم المضاد المضاد ل CD 16 الموضح باللون الأحمر يتراكم على الطبقة الدهنية الثنائية التي تؤدي إلى تكوين الأكتين F ، واستقطاب واختراق البيرفورين الموضح باللون الأزرق من خلال شبكة الأكتين f في اللوحة البؤرية. باستخدام هذا النهج المشترك ، يمكن للمرء أن يلاحظ بشكل نظيف المجموعات الدقيقة من مضاد CD 16 المسمى بالفلورسنت داخل طبقة الدهون الثنائية المدعومة بالزجاج ، والتي تعكس مباشرة تجميع CD 16 على خلية NK. بالمقارنة مع الصورة التقليدية متحد البؤر ، يمكن تمييز الهيكل الحلقي للمجموعة المركزية CD 16 بسهولة أكبر في الصورة الثابتة بسبب التألق المحيط المستنفد.

علاوة على ذلك ، ينظر إلى البنية الفائقة للهيكل الخلوي للأكتين بدقة محسنة بشكل كبير. تمشيا مع الملاحظات السابقة ، تظهر حبيبات الليتيك الإيجابية بيرين موضوعة فوق مناطق ذات كثافة منخفضة من الأكتين F. في الصورة بدلا من ذلك ، وهي تفاصيل مهمة تضيع في الغالب في الصورة متحدة البؤر بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية حوالي أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح أثناء المرور بها.

من المهم أن تتذكر أن تحافظ على عينتك خالية من الأكسجين من خلال إزاحة الأكسجين بشكل متكرر بالأرجون ، وعند تجميع الغرفة عن طريق وضع زلة الغطاء بسرعة فوق العينة وغمرها في محلول الغلاف.