ترنسفكأيشن، اختيار، ومستعمرة قطف من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية TALEN المستهدفة مع جين GFP في AAVS1 الملاذ الآمن

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد AA معزول مقابل ملاذ آمن واحد ، أو خلية جذعية مستهدفة محفزة متعددة القدرات أو استنساخ IPSC تعبر عن GFP. يتم تحقيق ذلك من خلال تسليم بلازميدات AAVs واحدة مخالب و A VS واحدة C-A-G-E-G-F-F بكفاءة في IPCs عن طريق عاطفة النواة. في الخطوة الثانية ، يتم تحديد الخلايا المستهدفة A a مقابل واحدة بواسطة pur mycin على خلايا التغذية الجنينية للفأر.

بعد ذلك ، يتم اختيار GFP الفردي الذي يعبر عن المستنسخة المستهدفة A A مقابل واحد في لوحة بئر 96 مطلية ب matrigel. في الخطوة الأخيرة ، تم توسيع استنساخ A A VS ONE G-F-P-I-P-S-C باستخدام E ثماني تقنيات ثقافة IPSC متوسطة وقياسية. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي الفلوري وقياس التدفق الخلوي لإظهار التعبير المنتظم والقوي ل GFP في AA مقابل واحد مستنسخة IPSC البشرية المستهدفة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات اختيار المستعمرة تتضمن تشريحا دقيقا للنسخ المستهدفة باستخدام أدوات انتقاء مستعمرة خاصة تحت المجهر ، والتي يصعب تعلمها أثناء التعليمات جنبا إلى جنب. ابدأ بغسل ثقافات IPSC مرة واحدة مع كل منها باستخدام PBS. ثم أضف ملليلترا واحدا من كاشف تفكك الخلايا اللطيف 37 درجة مئوية إلى كل بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا عندما ينفصل أكثر من 50٪ من الخلايا عن وعاء الاستزراع.

استخدم ماصة P 1000 لتعطيل أي كتل خلايا متبقية أو خلايا متصلة ميكانيكيا. ثم أضف ملليلترين من E ثمانية متوسطة إلى كل بئر واستخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لتقسيم المزارع إلى معلقات أحادية الخلية. الآن قم بتجميع الخلايا المحصودة في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بتدويرها.

أعد تعليق الحبيبات بكمية لا تقل عن E ثمانية وسط للعد. ثم بعد التأكد من جدوى الثقافات عن طريق استبعاد الأزرق الثلاثي ، بالإضافة إلى تفكيكها الكافي ، نقل 3 ملايين خلية إلى كل من أنبوبين مخروطيين سعة 15 مليلتر بينما قامت خلايا الطرد المركزي بضبط نظام التثقيب الكهربائي على برنامج نوع الخلية المحدد لخط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H تسعة. ثم أضف 10 ميكروغرامات من المتبرع المتسلسل لإعادة التركيب وحده إلى حبيبات واحدة لعينة التحكم و 10 ميكروغرام من البلازميد المتبرع المتبرع بإعادة التركيب المتماثل ، جنبا إلى جنب مع خمسة ميكروغرامات من كل بلازميد تالون للعينة التجريبية.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول تعداء الخلايا الأساسية P الكامل بدرجة حرارة الغرفة إلى كل من الكريات التجريبية والتجريبية وأعد تعليق الخلايا. انقل العينات إلى كوفيت فردية ثم أكلت العينات مباشرة بعد التعداد. أضف 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة E ثمانية متوسطة إلى كل طبيب بيطري Q ثم انقل عينات IPSC المنقولة بالتنقيط إلى أطباق فردية بطول 10 سم تحتوي على DR أربعة خلايا ليفية جنينية للفأر قبل قطف المستعمرات ، شارك في التدريس جيدا للوحة 96 بئر مع 50 ميكرولترا من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي ثم قم بتخزين اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية في صباح اليوم التالي.

عندما تصل اللوحة إلى درجة حرارة الغرفة ، استنشق المحلول الزائد وقم بتحميل كل بئر ب 100 ميكرولتر من E ثمانية وسط مكمل ب 10 ميكرومولار Y 2 7 6 3 2. بعد ذلك ، ضع مجهرا مقلوبا في خزانة السلامة البيولوجية وقم بتعقيمه برذاذ خفيف بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم ضع ماصة المراعي الزجاجية فوق موقد بنسن لإنشاء أداة قطف مستعمرة بخطاف صغير عند طرفه بعد التعقيم بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ضع الخطاف في الغطاء حتى يجف ثم ضع ثقافة IPSE على مرحلة المجهر لاختيار المستنسخة. حدد موقع مستعمرة مناسبة بتكبير منخفض واستخدم أداة انتقاء المستعمرة لتتبعها وأرباعها. ثم اكشط المستعمرة المقسمة برفق من وعاء الاستزراع واستخدم ماصة P 200 مضبوطة على حوالي 30 ميكرولترا لتجميع IPCs العائمة بحرية التي تطليح الخلايا مباشرة على مصفوفة الغشاء القاعدي.

أثناء حصادها ، يجب أن تعلق IPCs في غضون ساعتين إلى أربع ساعات من الطلاء. أخيرا ، احتضان المستعمرات المنتقاة طوال الليل عند 37 درجة مئوية وقم بتحديث الخلايا بوسط E ثمانية كامل في صباح اليوم التالي. من المهم نقل PSCs عالية الجودة فقط طوال التجربة.

يجب أن تحتوي ثقافات IPSC بشكل أساسي على مستعمرات متميزة تحمل حجرا مرصوفا بالحصى مثل التشكل حيث تظهر الخلايا هنا ويجب ألا تزيد الخلايا المتمايزة عن 10٪ من الثقافة ، ويمكن تقييم قدرة الشفافية ل IPCs وتحسينها باستخدام ناقل PAX GFP الصغير حيث يمثل التعداء باستخدام PAX GFP عادة أقصى كفاءة يمكن تحقيقها نظرا لصغر حجمها. يبلغ التعبير العابر ل A VS واحد C-A-G-E-G-F-P intel و IPCs المنقولة ذروته في 48 إلى 72 ساعة بعد التعدي ، والذي يمكن تأكيده مع جزء صغير من الخلايا المنقولة عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تختلف كفاءة التعدي اختلافا كبيرا.

حتى في التجارب مع الكسر الإيجابي ل GFP هو 10٪ فقط يجب أن تكون المستنسخة الفردية التي تعرض مضان موحد كبيرة بما يكفي لقطف المستعمرة بعد اختيار المايسين النقي. علاوة على ذلك ، مرة واحدة في 96 ، يجب أن تظهر استنساخ IPSC المستهدفة الموسعة تعبيرا مستقرا وموحدا عن GFP. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل I PSCs بكفاءة عن طريق المودة النووية وكيفية عزل AV One Safe Harbor.

استنساخ IPSE المستهدف باستخدام أدوات انتقاء المستعمرات.