التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الآليات التي تنظم الخلايا البدينة وتطور الحبيبات الإفرازية والتكريات. يتم تحقيق ذلك عن طريق أول سرير أطفال ينقل الخلايا البدينة بجين مراسل لإفراز الخلايا ، بالإضافة إلى جين مثير للاهتمام. الخطوة الثانية هي تقييم تأثير الجين المختبر على إفراز الخلايا عن طريق تحفيز الخلايا ومراقبة إشارة الفلورسنت لجين المراسل أثناء إفراز الخلايا.

بعد ذلك ، يتم تقييم تأثير الجين الذي تم اختباره على توليد حبيبات سكرتير الخلايا البدينة وتطورها عن طريق التصوير متحد البؤر لجين المراسل المترجم إلى حبيبات السكرتير. الخطوة الأخيرة هي إجراء تحليل مورفو متري للحبيبات الإفرازية. في نهاية المطاف ، يتم استخدام وضع العلامات الفلورية على حبيبات إفراز الخلايا البدينة باستخدام جين مراسل لإظهار التغيير في الخلايا البدينة وتطور الحبيبات الإفرازية وإفراز خلوياتها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل قياس إطلاق الوسطاء الذاتيين ، بيتا هاز ، أو الهيستامين ، هي أنها تعتمد على التعبير المشترك عن الجين محل الاهتمام أثناء نوع متحولة أو S-H-R-N-A جنبا إلى جنب مع مراسل لإفراز الخلايا. يسمح التعبير المشترك بعد ذلك بمراقبة الإفراز حصريا من الخلايا التي تم التلاعب بها وراثيا ، وبالتالي التغلب على مشكلة نسبة الضوضاء العالية إلى الإشارة التي تنشأ عند قياس إطلاق الوسطاء الذاتيين بسبب انخفاض قدرة الخلايا البدينة على الشفافية ، مما يعيق تفسير النتائج. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية للخلايا البدينة ، مثل تحديد الآليات الجزيئية التي تتحكم في عملية توليد الحبيبات الإفرازية ، بما في ذلك اختيارات calgo ، وتغليف الحبيبات ، وكفاءتها في التخلي الخلوي.

تساعد هذه الطريقة أيضا في تحديد الآليات الجزيئية التي تتحكم في عملية الخلايا الكتلية المنظمة للخلوي الخارجي من خلال تقييم مشاركة الكينازات والفوسفوتاز وعائلة البروتينات الأخرى في هذه العملية. للبدء ، قم بإعداد خلايا ووسائط سرطان الدم القاعدية للفئران كما هو موضح في بروتوكول النص لإجراء التعدين. أولا ، قم بإزالة وسط الاستزراع من اللوحة باستخدام ماصة مراعي معقمة متصلة بالفراغ.

اشطف الخلية أحادية الطبقة باستخدام التربسين الدافئ ، وهو DTA يغطي الطبقة الأحادية بالكامل. ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 10 دقائق. ثم تحقق مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت باستخدام المجهر البصري.

بمجرد فصلها ، أضف وسيطا إلى لوحة الثقافة لتعليق الخلايا بحجم لا يقل عن ضعف حجم محلول التربسين. بعد حساب رقم الخلية ، باستخدام بيليه مقياس الخلوي الدموي ، 15 مليون خلية عن طريق الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 200 جم و 25 درجة مئوية. تخلص من SNAT وأضف 280 ميكرولتر من وسط التعداد.

ثم انقل خليط التفاعل إلى أربعة ملليمترات. أضف 20 ميكروغراما من البلازميد الذي يحتوي على البلازميد العصبي Y-M-R-F-P ، المعروف أيضا باسمه المختصر N-P-Y-M-R-F-P ، وإما 30 ميكروغراما من التحكم أو البلازميد الفارغ أو البلازميد المختبر. يجب أن يكون الحجم النهائي لخليط التفاعل 300 ميكرولتر.

بعد وضعه على الثلج لمدة 10 دقائق ، امسح الطبيب البيطري خاليا من الماء المتبقي. ثم انتقل إلى التثقيب الكهربائي عند 300 فولت لمدة تسعة مللي ثانية. لقياسات إفراز الخلايا ، قم بإعادة تدوير الخلايا على الفور في 24 ، أطباق زراعة الأنسجة الجيدة التي تحتوي على 300 ميكرولتر من المتوسط.

أضف ثمانية ميكرولترات من خليط التفاعل لكل منهما. حسنا ، أضف الخلايا غير المنقولة إلى آبار إضافية للتحكم. قم بإعداد ما يكفي من الآبار للحصول على آبار مكررة لكل علاج ، لكل تعداء للفحص المجهري بفاصل زمني ، قم بإعادة تشكيل الخلايا على الفور في نظام زجاجي بغطاء سيليكات BO مكون من ثماني غرف آبار يحتوي على 80 ميكرولتر من المتوسط.

أضف 1.5 ميكرولتر من خليط التفاعل إلى كل غرفة لتوعية الخلايا من أجل التنشيط بوساطة FC epsilon R واحد. أضف ميكروغراما واحدا لكل مليلتر من IgE أحادي النسيلة الخاص ب DNP إلى الوسائط. احتضان الخلايا باستخدام IgE لمدة ساعتين على الأقل.

بعد 18 إلى 24 ساعة ، استخدم المجهر الفلوري للتأكد من أن الخلايا تعبر عن البلازميدات. يبلغ طول موجة الإثارة MRFP 584 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 607 نانومتر. يجب أن تظهر N-P-Y-M-R-F-P في الهياكل الحويصلية التي تتوافق مع حبيبات السكرتير.

لقياس إفراز الخلايا N-P-Y-M-R-F-P ، قم بإزالة وسط الزراعة. من صفيحة 24 بئر وغسلها ثلاث مرات باستخدام عازلة تايرو. قم بإعداد الخلايا غير المحفزة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من عازلة التايرو إلى آبار التحكم.

ثم أضف الكواشف المنشطة ، عازلة التيرو المخففة قبل التحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. انقل المواد الطافية S لكل بئر بعناية إلى طبق 96 بئر. ضع الطبق على الثلج واحميه من الضوء.

تحتوي المواد الطافية S على الببتيد الخيمري N-P-Y-M-R-F-P الذي تم إطلاقه من الخلايا. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من عازلة التايرو التي تحتوي على 0.5٪ تريتون × 100 لكل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. هذه الخطوة مهمة لتحضير محللات الخلايا التي تحتوي على ما تبقى من N-P-Y-M-R-F-P الذي لم يتم إطلاقه من الخلايا.

اجمع محللات الخلية وانقلها إلى طبق 96 بئر قبل وضعها على الثلج. في حالة عدم وجود ضوء ، قم بقياس تألق المواد الطافية للخلية ومحللات الخلايا باستخدام قارئ لوحة مضان مع مرشح إثارة بعرض النطاق الترددي 590 نانومتر و 20 نانومتر و 635 نانومتر. بذرة مرشح انبعاث عرض النطاق الترددي 35 نانومتر 1.5 ميكرولتر من الخلايا المنقولة في نظام زجاجي بغطاء سيليكات BO مكون من ثماني غرف.

احتضان الخلايا لمدة 18 إلى 24 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة وسط الثقافة من الغرف واغسله ثلاث مرات باستخدام عازلة التيرويد. ثم أضف 72 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتيرويد إلى كل غرفة.

استخدم مجهر مضان متحد البؤر مزودا بوحدة تحكم في ثاني أكسيد الكربون في الغرفة الساخنة وهدف 40 × أو 63 ×. قم بتشغيل أنظمة المجهر ، بما في ذلك مصباح الزئبق والكمبيوتر والليزر. تأكد من أن الغرفة المسخنة في درجة الحرارة المناسبة.

قبل البدء في التجربة ، ضع نظام زجاج غطاء السيليكات ذو الثمانية غرف في الغرفة الساخنة وتأكد من تثبيت الغرفة بشكل صحيح ومستقرة. قم بتشغيل ضوء التألق وفقا للطابق الرابع ذي الصلة وتصور الخلايا المنقولة ، وقم بإيقاف تشغيل التألق بمجرد وجود خلية ذات أهمية في هذا المجال. من أجل تقليل التبييض والسمية الخلوية ، يجب أن يحتوي هذا الحقل على حوالي خليتين إلى ثلاث خلايا منقولة بحيث تنتشر جيدا ولكن لا تلامس بعضها البعض.

في هذه الحالة ، يتم نقل الخلايا بجين المراسل ، N-P-Y-M-R-F-P و GFP الموسومة بشكل أساسي RAB خمسة متحول. اضبط طاقة الليزر لتقليل الضوضاء والتشبع الزائد بالإضافة إلى السمية ، واضبط الكسب والإزاحة لتعديل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. مسح سريع لتقليل مدة عرض الليزر.

بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات Zack لإعادة بناء الصورة في ثلاثة أبعاد. اضبط حجم الثقب على وحدة منطقة واحدة لإعطاء أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء والحصول على مسح ضوئي متتالي للشرائح البصرية ثنائية البؤر ثنائية الأبعاد في المحور Z مع شرائح بصرية ، أقل من أو يساوي 0.7 ميكرومتر. الآن اضبط الفاصل الزمني بين كل عملية استحواذ على 30 ثانية ومدة الاستحواذ الإجمالي على 15 دقيقة وابدأ في الحصول على الصور بعد خمس دقائق من الاستحواذ.

أوقف السلسلة الزمنية مؤقتا ، وأضف ثمانية ميكرولترات من الزناد 10 × واستمر في الاستحواذ على الفور. أخيرا ، احفظ الصور. قم بإجراء الالتفاف باستخدام برنامج deconvolution وإعادة بناء المكدسات إلى صور ثلاثية الأبعاد وفيلم لإجراء تحليل الصور.

استيراد البيانات من صور السلاسل الزمنية المعقدة التي تم الحصول عليها عن طريق المجهر الفلوري متحد البؤر إلى برامج تحليل الصور العلمية مثل MRS. يقرأ هذا البرنامج أكثر من 40 ملف مجهري. لإضافة نقاط زمنية إلى نهاية مجموعة بيانات مفتوحة، حدد تحرير إضافة نقاط زمنية واستيراد مجموعة البيانات الجديدة.

اضبط التباين وظل اللون للحصول على عرض الصورة الأمثل. تقوم الملفات التي تم تنزيلها بإنشاء سطح قناة MRFP. باستخدام خيار معالج السطح.

اختر الخوارزمية الافتراضية وتحدد القناة N-P-Y-M-R-F-P خيار التنعيم لتقليل الضوضاء. لتجنب فقدان التفاصيل الصغيرة ، قم بتقليل مستوى تفاصيل المنطقة إلى ما بين 0.05 و 0.1 ميكرون. بعد ذلك ، قم بتعيين عتبة الشدة.

يتم عرض سطح رمادي جديد. ثم انتقل إلى الإعدادات وقم بتبديل النمط من نقطة مركزية إلى أخرى. انتقل إلى علامة التبويب الإحصاء في خصائص الكائن المحدد.

ثم حدد علامة التبويب التفصيلية والقيمة المحددة مثل التألق أو الشدة أو الحجم. راجع البيانات وتأكد من أن القيم متوافقة مع الصور. على سبيل المثال ، يمكن قياس حبيبات متجاورة أو أكثر على أنها حبيبات أكبر لتحديد متوسط حجم الحبيبات.

اقسم حجم حبيبات البضائع على العدد الفعلي للحبيبات. كخطوة أخيرة ، قم بتصدير مجموعات البيانات المطلوبة إلى ملفات Excel وتحليل البيانات. تظهر هنا صور تمثيلية بفاصل زمني للحبيبات الإفرازية العملاقة للخلايا البدينة التي تشكلت عن طريق التعبير عن RAB الخمسة النشط بشكل أساسي ، بالإضافة إلى حركية إفراز الخلايا ودقة حبيبات إفرازية واحدة.

بعد التحفيز. أثناء إفراز الخلايا البدينة ، تتحرك حبيبات السكرتير نحو غشاء البلازما وتندمج معه. الحبيبات مغلفة بواسطة RAB النشط بشكل أساسي خمسة موضح باللون الأخضر.

بعد ذلك إطلاق شحنة السكرتير ، وهي N-P-Y-M-R-F-P في هذه التجربة والملونة باللون الأرجواني ، من الخلايا إلى الفضاء خارج الخلية. الحبيبات التي تم دمجها بواسطة الطفرة النشطة بشكل أساسي ل RAB خمسة الموضحة في الإصدار الأخضر. شحنتهم N-P-Y-M-R-F-P التي في هذه التجربة ملونة باللون الأرجواني من الخلايا إلى الفضاء خارج الخلية.

يؤدي إطلاق N-P-Y-M-R-F-P أثناء إفراز الخلايا إلى زيادة كبيرة في شدة مضان N-P-Y-M-R-F-P وانكماش الحبيبات الإفرازية المحتوية على N-P-Y-M-R-F-P متبوعا باختفائها ، وشدة الفلورسنت للحبيبات الإفرازية. بعد تحفيز الخلايا بأيونوفور الكالسيوم ، يتم عرض الحبيبات الإفرازية لإفراز الخلايا في نقاط زمنية مختلفة. في حين أن حبيبات إفرازية واحدة لم تندمج مع غشاء البلازما وظلت شدة التألق ثابتة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة حبيبات إفراز الخلايا ma أثناء التطور وإفراز الخلايا باستخدام مراسل جيني فلوري يتم تسليمه إلى حبيبات الإفرازية ويتم إطلاقه بواسطة الخلايا المحفزة. جنبا إلى جنب مع الوسطاء الذاتية ، يمكن تحديد الآليات الكامنة وراء الخلية البدينة ، وتطور الحبيبات الإفرازية ، وإفراز الخلايا باستخدام هذا الإجراء عن طريق الاستمرار ، وفحص الخلايا بجين تقرير وجين اختبار. يمكن تقييم دور جين المختبر في تطور حبيبات إفراز الخلايا البدينة من خلال إجراء تحليل مورفومتري للحبيبات الإفرازية للخلايا التي يتم نقلها مع الجين المعني مقارنة بخلايا التحكم.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد دور الجين المختبر في التخلي الخلوي المنظم من خلال مراقبة إطلاق جين المراسل.