في الموقع الكالسيوم ²⁺ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

الجهاز العصبي المعوي (ENS) هو شبكة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الموجودة في جدار الأمعاء والتي تتحكم في ردود الفعل المعوية. يصف هذا البروتوكول طرق تسجيل نشاط الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية في الاستعدادات الحية ل ENS باستخدام تصوير Ca²⁺.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير نشاط الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية في مستحضرات الجبل الحية الكاملة للأمعاء باستخدام أصباغ مؤشر الكالسيوم الفلورسنت. يتم تحقيق ذلك عن طريق استئصال جزء من الأمعاء أولا من ووضعه في وسط دافئ. الخطوة الثانية هي فتح الأمعاء على طول الحدود المساريقية وتثبيتها بشكل مسطح تحت توتر خفيف مع توجيه سطح مخاطي لأعلى.

يتم تحضير مستحضرات التثبيت الكاملة للضفيرة العضلية المعوية عن طريق التشريح المجهري وتوضع في أطباق التصوير. بعد ذلك ، يتم تحميل مستحضرات التثبيت بالكامل بمؤشر الفلورسنت صبغة الأنفلونزا أوه أربعة في حاضنة. في الخطوات النهائية ، يتم تصوير المستحضرات المحملة باستخدام مجهر تصوير فلوري مزود بكاميرا عالية الدقة يتم التحكم فيها بواسطة برنامج الحصول على الصور وتحليلها لتسجيل نشاط خط الأساس.

ثم تضاف الأدوية قيد التحقيق ويتم تسجيل عابرات الكالسيوم في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. في نهاية المطاف في الموقع. يستخدم تصوير الكالسيوم للجهاز العصبي المعوي لدراسة كيف يساهم النشاط الخلوي في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في تنظيم وظائف الأمعاء الفسيولوجية وخلل الجهاز العصبي المعوي في الفيزيولوجيا المرضية للأمعاء.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو إنشاء فهم لفسيولوجيا الفيزيولوجيا المرضية لاضطرابات الأمعاء الوظيفية وأمراض الأمعاء الالتهابية من خلال استخدام طريقة بسيطة وقوية لفحص التفاعل المعقد بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المعوية باستخدام NC اثنين من تصوير الكالسيوم الذي يوضح أن هذا الإجراء سيكون ديفيد مجانيا للعلماء من مختبري. تتوافق الإجراءات التالية التي تنطوي على أنسجة من المختبر مع إرشادات A VMA للقتل الرحيم للحيوانات 2013 ، وقد تمت الموافقة عليها مسبقا من قبل جامعة ولاية ميشيغان I-A-C-U-C بعد القتل الرحيم للحيوان وفقا للإجراءات المعتمدة ، ضع في وضع ضعيف ونظف الجلد فوق البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم الملقط لقرص جلد البطن عند خط الوسط ثم استخدم المقص الجراحي لعمل شق وسطي بطول ستة سنتيمترات على طول الكوع الخطي لكشف الأعضاء الهضمية الداخلية.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا غير حاد لتحديد موقع القولون داخل الصفاق وفضحه. قطع المساريق اللفائفي بالقولون بالمقص وابدأ في تفكيك الأمعاء. بمجرد أن يتم تفكيك طول الأمعاء بشكل كاف ، قم بقطع القولون البعيد عن الأعور والقريب من المستقيم لتحضير الأمعاء الغليظة ، والذي سيتم عرضه في هذا الفيديو.

ثم قم بإزالة الجزء المعوي بسرعة وضعه في دورق يحتوي على DM EMF 12 Media مكملا بثلاثة ميكرومولار نيكارديبين هيدروكلوريد وميكرومولار S scopolamine hydrochloride على الجليد. تسهل إضافة هذه المثبطات التشريح الدقيق والتصوير اللاحق عن طريق شل العضلات الملساء في الأمعاء. قم بإزالة جزء صغير من أربعة إلى ستة سنتيمترات من الجزء الأمعاء المطلوب وضعه في طبق بتري مغطى بواقي السيل مليء بوسائط مكملة مبردة.

ثم قم بتأمين الأطراف القريبة والبعيدة من الجزء المعوي بدبابيس الحشرات وافتح الأنبوب المعوي عن طريق عمل قطع مستقيم بالطول على طول الحدود المساريقية. الآن قم بتثبيت الأنسجة بشكل مسطح تحت التوتر الخفيف مع جانب الغشاء المخاطي لأعلى وقم بتشريح الطبقة المخاطية بعناية عن طريق رفع الغشاء المخاطي بالملقط الناعم رقم خمسة وقطع الأسفل بمقص زنبركي ناعم جدا. قم بتقطيع الأنسجة إلى مستحضرات أصغر تبلغ مساحتها حوالي 0.5 سم مربع وضع كل قطعة في طبق تصوير مملوء بالوسائط المكملة وضعها على الثلج.

قم بتثبيت كل مستحضر في أربع زوايا مع وجود طبقة عضلية دائرية متجهة لأعلى. قم بتشريح العضلة الدائرية بعناية عن طريق إغاظتها بملاقط دقيقة. لفضح الضفيرة العضلية المعوية ، تجنب التمدد المفرط ، ضع أطباق التصوير مرة أخرى على الجليد واستبدل المحلول في كل طبق بوسائط مكملة طازجة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الأطباق من الثلج وأضف ملليلترين من مزيج الإنزيم إلى كل طبق واحتضانها في درجة حرارة الغرفة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ الهواء لمدة 15 دقيقة. أخيرا ، اغسل مستحضرات الأنسجة بالوسائط ثلاث مرات وكبح جماح الزوايا أثناء العمل في ظروف الإضاءة المحدودة لتجنب التبييض الضوئي عند 1.5 مل من الوسائط المكملة و 1.2 ميكرولتر من مخزون بروبيت 250 مليمولار إلى 1.5 ميكرولتر Eloqua من أربعة ملليمولار Fluro أربعة مخزون عند حوالي 1.5 مل من الأنفلونزا أو أربعة محلول تحميل لأطباق التصوير واحتضانها في حاضنة مظلمة عند 37 درجة مئوية لمدة 45 محضر. بعد إزالة الأطباق من الحاضنة ، اغسل المستحضرات ثلاث مرات بالوسائط.

ثم أضف وسائط جديدة تحتوي على 200 حمض دعامة ميكرومولار لتعزيز وضع العلامات العصبية واحتضانها كما كان من قبل لمدة 15 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بعمل عازلة Krebs معدلة وفقا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكول ، وأضف ثلاثة نيكارديبين ميكرومولار وسكوبولامين ميكرومولار واحد لتثبيط تقلصات العضلات. أثناء التصوير بالكالسيوم الثاني بالإضافة إلى التشريح وتشريح التثبيت بالكامل ، ضع غرفة التسجيل تحت المجهر الفلوري وباستخدام نظام تروية تدفق الجاذبية مع خزانات حقنة ساخنة متعددة.

قم بإنشاء معدل نضح مستمر من اثنين إلى ثلاثة ملليلتر في الدقيقة بزاوية 37 درجة مئوية من المخزن المؤقت كريبس. تأكد من منع تكوين فقاعة الهواء في كل من المدخلات وخط الشفط المتصل بمصيدة التفريغ. اجعل الضفيرة المطلوبة في بؤرة التركيز تحت إضاءة المجال الساطع.

تجنب الإفراط في تعريض الأنسجة مما قد يؤدي إلى التبييض الضوئي. افحص الأنفلونزا أربعة تحميل داخل العقد واختر العقد السليمة للتصوير. ستظهر العقد التالفة غير الصحية التألق الذاتي أو مورفولوجيا ثقب ويجب عدم استخدامها للتصوير.

بمجرد تحديد العقدة ، قم بتحويل مسار الضوء إلى الكاميرا واحصل على صورة حية. باستخدام برنامج الحصول على الصور ، تأكد من أن العقدة في بؤرة التركيز وقم بتعيين معدل الحصول على الصور وأوقات التعرض ، وستختلف معدلات وأوقات الحصول على الصور اعتمادا على الأحداث التي يرغب المحققون في تسجيلها. بالنسبة لمعظم التجارب ، يتم الحصول على الصور تقليديا عند 0.5 إلى هرتز واحد للخلايا الدبقية وما يصل إلى اثنين إلى 10 هرتز.

بالنسبة للخلايا العصبية ، نظرا لأن الكالسيوم الدبقي العابر ليس سريعا مثل الخلايا العصبية العابرة للكالسيوم ، ابدأ التسجيل وقم بإنشاء نشاط فسيولوجي أساسي للعقدة المختارة في حالة عدم وجود محفزات تجريبية لمدة 30 ثانية. ثم قم بتطبيق الأدوية الدافئة ذات الأهمية مثل ناهضات المستقبلات والمضادات باستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية بمعدل اثنين إلى ثلاثة ملليلتر في الدقيقة وفقا لبروتوكول محسن للدواء الخاص بك. أوقف التسجيل واعرض فيلم اللقطات المتتابعة للتجربة.

حدد بعناية مناطق الاهتمام أو عائد الاستثمار باستخدام برنامج تحليل الصور المناسب. أخيرا ، استخدم برنامج التصوير المناسب لتطبيع ومقارنة شدة الفلورسنت للمناطق ذات الأهمية مقابل خط الأساس الأولي ، تتناسب تغيرات القيمة في التألق الطبيعي طرديا مع التغيرات في الكالسيوم. توضح الصور الثلاث التالية أن الخلايا الدبقية المعوية في خنزير غينيا تستجيب ل TP في الموقع.

في ظل الظروف القاعدية ، يكون التألق الفلوري الرابع منخفض المستوى كما هو موضح في الخط المتقطع مرئيا. تشير الأسهم إلى مسارات ألياف سميكة بين العقدة عند التحفيز ب 100 ميكرو مو لكل لتر الخلايا الدبقية TP ، ولكن ليس الخلايا العصبية تزيد بسرعة من فلورو أربعة مضان مما يشير إلى زيادة في الكالسيوم. لاحظ أن الخلايا المستجيبة صغيرة وتحيط بالخلايا العصبية الأكبر بكثير التي تشير إليها المساحات المظلمة المميزة بعلامة النجمة.

يوضح هذا الرسم البياني أن الدبقية المعوية تستجيب ل TP بطريقة تعتمد على الجرعة مع مللي مول واحد لكل لتر مما يثير استجابات قصوى. يظهر هذا الفيديو عقدة معوية من القولون البعيد للفأر محملة بالكالسيوم اثنين بالإضافة إلى مؤشر صبغة الأنفلونزا أوه أربعة. يضاف ناهض الخلايا الدبقية DP إلى الحمام عند الحاجة.

يثير DP زيادة في الكالسيوم داخل الخلايا اثنين زائد في الخلايا الدبقية المعوية كما لوحظ من خلال الارتفاع العابر في الأنفلونزا أوه أربعة مضانة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص التفاعل المعقد بدقة بين الخلايا العصبية واستخدام تصوير الكالسيوم تجريبيا. يتطلب توصيف الآليات والعواقب الوظيفية المحتملة لاستجابات الكالسيوم في مستحضرات التركيب بالكامل تشريحا دقيقا للحصول على جودة تصوير مثالية.

يتيح استخدام الملصقات الفلورية والمحفزات الدوائية داخل هذه التقنية القائمة على الفحص المجهري تقييما محسنا لهذه الخلايا في بيئتها الأصلية متعددة الخلايا.