تقييم المنقولة جنون الأنواع دماغي الحواجز مع

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم حاجز الأنواع لاعتلالات الدماغ الإسفنجية السارية، المعروفة باسم TSC، تجاه نوع معين دون الحاجة إلى تعريض الحيوانات الحية للإصابة. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير ركيزتين لمقايسة التحويل لاستخدامهما في مقايسة مخبرية. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضين هذه الركائز مع عوامل TSE التي ترغب في اختبارها لاحقاً.

بعد الهضم باستخدام Protase K، تخضع العينات لتقنية SDS page واللطخة المناعية. وتتمثل الخطوة النهائية في قياس كمية بروتين PreOn المقاوم لـ proteinase K في كل ركيزة باستخدام D cytometry ومقارنة هذه الكميات عن طريق حساب نسبة كفاءة التحويل أو CER. وفي النهاية، توفر CER مقياساً لحاجز الأنواع لـ TSE المختبر بالنسبة لنوع المضيف الذي تم تحضير الركيزة منه.

تشمل مزايا هذا المقايسة تكلفتها المنخفضة، وإطارها الزمني التجريبي القصير، واستبدال الحيوانات الحية بعينات من الأنسجة. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة مناسبة تماماً لتوفير نظرة متعمقة حول الحواجز النوعية لأمراض البريون في الحياة البرية، إلا أنه يمكن تطبيقها على أي أنواع أخرى ذات أهمية. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبات في تحضير الركيزة، ومراقبة الجودة، والتوحيد القياسي.

بعد الحصول على أنسجة دماغية سليمة وغير مصابة من النوع المستهدف، قم بتحضير متجانس بنسبة 10% وزن/حجم في محلول منظم للتحلل (lysis buffer) باستخدام طاحونة خرزية أو هاون ومدقة. ثم قم بتحسين المتجانسات بشكل أكبر عن طريق إخضاعها لعملية تجنيس باستخدام حقنة وإبرة، مع استخدام إبر ذات قياسات متزايدة حتى يمكن سحب الركيزة وطردها بسهولة من خلال إبرة حقنة بقياس 27.

الآن، تحقق من قيم pH لمحاليل الركائز واستخدم حمض الهيدروكلوريك المركز أو هيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة لضمان بقاء pH كل ركيزة ضمن نطاق موجب أو سالب 0.05 من قيمة pH المستهدفة. قم بتدوير المحاليل باستخدام خلاط دوار (end over end mixer) في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ساعات. بعد ذلك، قم بترسيب البروتين عن طريق إضافة أربعة أضعاف حجم الميثانول إلى محاليل الركائز في كل أنبوب vortex مخروطي مع الخلط جيداً والتحضين عند درجة حرارة -20 °C لمدة تتراوح من 16 إلى 18 ساعة.

بعد فترة التحضين، قم بترسيب العينات عن طريق الطرد المركزي عند 13,000 G لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد ذلك، قم بصب السوائل الطافية والتخلص منها بعناية، واترك الميثانول يتبخر من الرواسب. استخدم مسحات قطنية للمساعدة في امتصاص الميثانول الملتصق بالجدار الداخلي للأنبوب.

تجنب ترك الكريات تجف بشكل مفرط. انتقل إلى الخطوة التالية عندما لا يكون الميثانول مرئياً، واستخدم كمية من محلول التخفيف (conversion buffer) مساوية لكمية مادة البداية من متجانس الدماغ لإعادة تعليق كريات البروتين. بعد إعادة التعليق، قم بإجراء سونيكة (sonication) قصيرة لمحاليل الركيزة لمدة 10 ثوانٍ.

قم بإجراء عملية السونكة باستخدام قرن كوبي (cup horn) عند حوالي 30% من القدرة القصوى. بعد ذلك، قم بتوزيع المحاليل في أحجام تتراوح من 0.5 إلى 1 مل في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل مرقمة، حيث يجب أن يكون بروتين البريون الخلوي في كلتا الركيزتين حساساً لإنزيم proteinase K. قم بمعالجة 10 إلى 25 µL من كل ركيزة باستخدام proteinase K بتركيز نهائي قدره 100 µg/mL، واهضم العينات عند 1000 RPM وبدرجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة في جهاز الرج الحراري (thermo shaker). حمّل الركائز المهضومة بواسطة proteinase K، جنباً إلى جنب مع 10 إلى 25 µL من كل ركيزة غير مهضومة.

على هلام SDS-PAGE، يتم إجراء الفصل الكهربائي ثم الحجب المناعي باستخدام جسم مضاد متخصص ببروتين البريون لتقييم بروتين البريون المضيف، والمقاومة لإنزيم proteinase K، ومستويات البروتين غير المهضوم. تُظهر هذه الصورة نتائج اللطخة المناعية؛ حيث يحتوي المساران الأولان على الركائز غير المهضومة، بينما يحتوي المساران على اليمين على الركيزة المهضومة بواسطة proteinase K.

إذا كانت مستويات البروتين في ركائز pH 7.4 و3.5 متقاربة في حدود 10% تقريباً وغير مقاومة لإنزيم proteinase K، فإن أزواج الركائز تكون مناسبة للاستخدام في دراسات CER. تُخزن الحصص الأخرى عند درجة حرارة negative 80 degrees Celsius حتى يحين وقت إجراء مقايسة CER. يجب التعامل مع عوامل TSE باستخدام احتياطات السلامة الحيوية المناسبة ووفقاً للإرشادات المؤسسية. بعد الحصول على أنسجة دماغية مصابة بـ TSE من الأنواع المستهدفة، يتم تحضير متجانس بتركيز 10% وزن/حجم في one XPBS عند pH 7.4 باستخدام طريقة التجنيس التي استُخدمت سابقاً لتحضير أزواج الركائز.

قم بتوزيع المتجانسات الناتجة في أحجام تتراوح من 100 إلى 300 µL في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 0.5 mL، وتُحفظ عند درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت إجراء مقايسة CER. للبدء، قم بإذابة كميات متساوية من ركائز CER غير المصابة ذات الرقم الهيدروجيني pH 3.5 و7.4، وأزواج من المحاليل البذرية المصابة بـ TSE ببطء عن طريق وضعها فوق طبقة من الثلج لمدة ساعة واحدة تقريبًا. بعد الإذابة، احتفظ بالمحاليل على الثلج، ثم أعد تجنيسها عن طريق سحب وطرد كل محلول ركيزة عبر إبرة حقنة قياس 27 gauge.

بعد ذلك، قم بمعالجة كل محلول مصاب بـ TSE بواسطة الموجات فوق الصوتية لفترة وجيزة لمدة 10 ثوانٍ عند حوالي 30% من القدرة القصوى. بعد ذلك، قم بتحضير تفاعلات التحويل في أنابيب PCR رقيقة الجدران ومنخفضة الارتباط ومصنفة، وذلك عن طريق سحب 95 µL من ركيزة CER المحضرة عند pH 7.4 في نسختين مكررتين في أنبوبين، و 95 µL من ركيزة CER المحضرة عند pH 3.5 في نسختين مكررتين في أنبوبين آخرين.

ثم أضف خمسة µL من محلول البذور المصابة بـ 10%TSE إلى أنبوب واحد من كل ركيزة ذات pH 7.4 و 3.5. وبالتوازي، أضف خمسة µL من محلول التحويل المنظم إلى الأنبوب الآخر من كل ركيزة ذات pH 7.4 و 3.5 للتحكم في التحويل غير النوعي غير القائم على القالب. كما يجب تحضير ضابط لبروتين البريون المقاوم لإنزيم proteinase K المدخل.

لكل عامل TSE يتم اختباره، أضف 5 µL من محلول البذرة المصابة بـ TSE بتركيز 10% إلى 95 µL من محلول التخفيف (conversion buffer) كعينة ضابطة. قم برج كل عينة لفترة وجيزة باستخدام جهاز الفورتيكس في أنبوب PCR مغلق لضمان خلط المادة الركيزة. بعد ذلك، استخدم جهاز طرد مركزي صغير (mini centrifuge) على سطح المختبر بنبضة قصيرة وسرعة منخفضة لإزالة أي حجم من خليط التفاعل العالق في غطاء أنبوب PCR.

ضع الأنابيب في جهاز هزاز حراري مكتبي (bench top thermo shaker) مجهز لاستقبال أنابيب PCR، ورُج العينات بسرعة 1000 RPM عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، أضف sarco cell ليصل التركيز النهائي إلى 2% وزن/حجم، وأضف proteinase K ليصل التركيز النهائي إلى 100 micrograms per milliliter؛ ثم قم بهضم العينات بسرعة 1000 RPM عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الهزاز الحراري. أضف محلول عازل لعينات SDS page، وسخن العينات عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم قم بفصل بروتين PreOn المتبقي والمقاوم لـ pronase K في كل عينة باستخدام SDS page، يليه إجراء immuno blotting كما سبق. وأخيراً، احسب نسبة كفاءة التحويل كمقياس لحاجز الأنواع.

وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب، تم تحضين ركيزة مقايسة CER للفئران، والمعدة عند pH 7.4 أو 3.5، مع سلالة scrapy المتكيفة مع الفئران RML، أو scrapy الأغنام المنزلية، أو مرض الهزال المزمن في الغزلان بيضاء الذيل، أو سلالة 2 63 K من scrapy المتكيفة مع الهامستر. وفي مقايسة CER، احتوت عينات الضبط التي تحمل علامة none على كمية متساوية من العامل المعدي، وتم تحليل عينات ركيزة الفئران للكشف عن وجود بروتين البريون المقاوم لبروتيناز K عن طريق اللطخة المناعية باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة SAF 83.

تُعرض قيم tric الخام لكل عينة أسفل كل مسار ناتج عن البروتينيز. كانت مستويات بروتين البريون المقاوم لـ K متغيرة عبر ركائز الفئران التي تم تغيير طبيعتها عند pH 7.4 وتم تلقيحها بعوامل TSE المختلفة. وبينما وُجد بروتين البريون المقاوم لـ pronase K في جميع الركائز التي تم تغيير طبيعتها عند pH 3.5 وتم تلقيحها بعامل TSE، يوضح هذا الرسم البياني الشريطي متوسط النسب زائد أو ناقص الانحراف المعياري بين ركائز الفئران عند pH 7.4 و 3.5 لكل عامل معدٍ بناءً على ثلاث جولات اختبار مستقلة على الأقل.

تشير الحروف الصغيرة إلى مجموعات فرعية متجانسة إحصائياً وفقاً لقيمة p أقل من 0.05 باستخدام تحليل التباين، وبطريقة Tookie Kramer للفروق ذات الدلالة الدنيا. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في أقل من 48 ساعة إذا أجريت بشكل صحيح. ويمكن استخدام مقايسة CER كتقييم أولي لوجود حاجز أنواع TSE، وهو ما قد يبرر أو يغني عن إجراء دراسات إضافية على الحيوانات الحية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الركائز، وإعداد تفاعلات التحويل، وحساب نسب كفاءة التحويل لتقييم الحواجز بين الأنواع.