الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل في المختبر المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون والعقدة الجذرية الظهرية أو الثقافات المشتركة للخلايا العصبية DRG لدراسة تجديد العصب في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون غير المتمايزة من أنسجة الدهون في الفئران. في الخطوة الثانية ، يتم تمييز الخلايا إلى خلايا تشبه شوان باستخدام مزيج من عوامل النمو.

بعد ذلك ، يتم حصاد الخلايا العصبية DRG من الحبل الشوكي للفئران وترتبط في الخطوة الأخيرة ، يتم تثبيت الخلايا العصبية على الخلايا الجذعية المتمايزة لتوليد نظام الزراعة المشتركة في المختبر. في النهاية ، يتم تلطيخ الخلايا للعلامات العصبية والدبقية لتسهيل نمو الخلايا العصبية والقياس الكمي والتصوير عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني للتقييم المورفولوجي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة مختلفة في مجال الطب التجديدي ، مثل كيفية تفاعل الخلايا الجذعية اليمنى الدهنية مع الخلايا العصبية العضوية على المواد الحيوية المختلفة؟

يعد سبب توضيح هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن هذا ينطوي على خطوات يصعب تعلمها بسبب قلة إمكانية الوصول وصغر حجم الأنسجة في خزانة بيولوجية. ابدأ باستخدام مقص وشفرة حلاقة معقمة لتقطيع الدهون الحشوية والإربية التي يتم حصادها من ذكور الفئران البالغة إلى تناسق جيد. بعد ذلك ، قم بنقل ملاط الدهون الناتج إلى أنبوب يحتوي على 15 مل من المرشح المحضر حديثا ، ومحلول الكولاجيناز المعقم من النوع الأول ووضع أنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

راقب توقف الهضم عن كثب قبل فصل الأنسجة تماما لتحسين بقاء الخلية وإنتاجها. عندما تصبح الأنسجة جاهزة ، قم بتصفيته من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون. سيؤدي الهضم الجيد إلى تناسق دهني متجانس يظهر باللون البيج مع دوامة لطيفة.

تحييد الإنزيمات الهاضمة ب 15 مل من وسط نمو الخلايا الجذعية 37 درجة مئوية المكمل ب FBS. ثم قم بتدوير الخلايا لجمع جزء الأوعية الدموية اللحمي. استنشق supinate بدءا من الطبقة العليا من الدهون.

أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من عازلة خلايا الدم الحمراء ISIS مع سحب العينات. بعد دقيقة واحدة ، أوقف التحلل بإضافة 10 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الطازجة والمتوسطة إلى الخلايا مرة أخرى. الآن استنشق بعناية طافي S.

أعد تعليق الخلايا في 10 مل من الوسط وزرع الخلايا في 75 سم مربع. قوارير عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. حافظ على الخلايا عند مستويات التقاء فرعية حتى الممر الأول أو الثاني الذي تكون فيه الخلايا جاهزة للتمايز إلى خلايا شبيهة بشوان عن طريق العلاج ببيتا المزيد من الإيثانول وحمض الريتينويك للحصول على الخلايا العصبية DRG بعد حصاد الحبل الشوكي.

ابدأ بإزالة أي أجزاء ظهرية ثم استخدم مقصا جراحيا معقما وحادا لتقسيم العمود الفقري إلى نصفين على طول المحور الطولي ، مما يؤدي إلى تعريض أنسجة الحبل السري. اقطع العمود الفقري إلى جزأين أصغر تحت مستوى القفص الصدري ، ثم استخدم ملقطا دقيقا لإزالة جميع أنسجة الحبل السري برفق. الحرص على عدم سحب وإزالة جذور DRG ، والتي تظهر على شكل خيوط بيضاء تخرج مباشرة من القنوات.

بمجرد إزالة كل الأنسجة الأساسية ، استخدم ملقطا دقيقا جدا لسحب جذر DRG بالكامل ، والوصول إلى عمق القنوات القابلة للقلب والحرص على عدم إتلاف جذور العقد. ضع DRG في طبق شجرة للحيوانات الأليفة بمساحة 60 ملم مربع يحتوي على ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من لحم الخنزير F 12 المتوسط المكمل بالمضادات الحيوية. ثم تحت مجهر تشريح ، استخدم ملقطا معقما ومشرطا لإزالة أي جذور عصبية زائدة تحيط بالعقد لتقليل تلوث الخلايا الساتلية.

بعد ذلك ، انقل DRG إلى طبق بتري بحجم 35 ملم مربع يحتوي على 1.8 مل من F 12 المتوسط الطازج وأضف 200 ميكرولتر من الكولاجيناز. اكتب أربعة حل الأسهم. احتضن DRG لمدة ساعة واحدة ثم استنشق الوسط بعناية باستخدام ماصة زجاجية.

الحرص على عدم الشفط أو إتلاف DRG. كرر خطوة الكولاجيناز واغسل DRG بوسط F 12. بعد الغسيل الثاني ، أضف 1.8 مل من F 12 medium و 200 ميكرولتر من التربسين إلى الخلايا.

إزالة التربسين وإضافة مليلتر واحد من الوسط المكمل ب 500 ميكرولتر من FBS لإيقاف التفاعل الأنزيمي. ثم استنشق الوسيط واغسل DRG برفق باستخدام F 12 medium ثلاث مرات لإزالة جميع آثار المصل. الآن قم بتغذية الخلايا بملليلترين من وسط F 12 الطازج واستخدم ماصة زجاجية لنقل تعليق الخلية بعناية إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

الماصة لأعلى ولأسفل من ثماني إلى 10 مرات لفصل الخلايا العصبية برفق ثم السماح للحنك بالتراكم في قاع الأنبوب عندما يستقر الحنك. انقل السوبينات إلى أنبوب جديد وأضف ملليلترين من وسط F 12 الطازج إلى الحنك. يصبح تكرار التفكك الميكانيكية والنقل المتوسط داخل التعليق متجانسا.

ثم أعد تقييم تعليق الخلية ثلاث إلى أربع مرات متبوعا بترشيح التعليق المتجانس الناتج من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب جديد سعة 50 مل. الطرد المركزي للخلايا في أنبوب سعة 15 مليلتر أثناء دورانها ببطء ماصة معدة حديثا. 15٪ من ألبومين مصل الأبقار أسفل داخل أنبوب سعة 15 مليلتر ، مثبت بزاوية 45 درجة لإنشاء مسار بروتين تدريجي.

باستخدام الأرقام الموجودة على الأنبوب كمرجع لمسار التشكيل ، ثم قم بسحب الأنفط من الخلايا ، وتوفير آخر 500 ميكرولتر للريسوس ، وتعليق الحبيبات وتوزيع الخلايا ببطء على طول مسار البروتين في الأنبوب الجديد. بعد تدوير الخلايا ، مرة أخرى ، قم بإعادة تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط BS المعدل وزرع الخلايا في حجم صغير من الوسط. في صفيحة 24 بئر لمدة ساعتين عندما تكون الخلايا قد تعلق إضافة وسيط BS جديد مكمل ب 15 نانوغرام لكل مليلتر من عامل نمو الأعصاب بعد التفكك.

يمكن أيضا استخدام خلايا DRG للزراعة المشتركة مع الخلايا الجذعية الدهنية الشبيهة بخلايا البجعة عن طريق زرعها فوق خلايا ما قبل البذرة. توضح هذه الصور أهمية الخلايا الجذعية الدهنية الشبيهة بخلايا شوان ل DRG Neurite التي تنبت في نموذج زراعة مشتركة باستخدام أغشية بولي كابرولاكتون كركائز. لم يلاحظ أي خلايا عصبية على الأسطح غير المعالجة في غياب الخلايا الجذعية الدهنية الشبيهة بخلايا البجعة ، في حين تم تحسين تكوين الخلايا العصبية بشكل واضح في نظام الزراعة المشتركة.

في المتوسط ، يزداد عدد الخلايا العصبية لكل جسم خلية بشكل كبير في وجود الخلايا الجذعية. في الواقع ، كما توضح هذه الصور ، فإن قدرة الخلايا العصبية DRG على إنبات الخلايا العصبية تحدث بشكل تفضيلي بالاقتران مع الخلايا الجذعية المتمايزة كما هو موضح في ارتفع الأسهم الصفراء. لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون الآن قادرا على الحصول على الخلايا الجذعية المشتقة من lib وفصل الخلايا العصبية DGen.

ولكن أيضا يجب أن تكون قادرا على إعداد نموذج للدراسة في متوسط التنكس المحيطي.