بوسلفان باعتباره وكيل كابت النقي لتوليد مستقرة الرفيع المستوى نخاع العظم الخيمرية في الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو استبدال مقصورة نخاع العظم في الفئران المستقبلة بخلايا نخاع عظم من فئران مانحة تعبر بشكل شامل عن البروتين الفلوري الأخضر، وذلك في غياب التشعيع. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تهيئة الفأر المستقبل عبر حقن متتالية داخل الصفاق للمركب المثبط للنخاع busulfan.

بعد ذلك، يتم عزل خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ وعظم الظنبوب لفأر مانح يعبر بشكل شامل عن البروتين الفلوري الأخضر. وفي الختام، تُزرع خلايا نخاع العظم المانحة في الفأر المستقبل المُهيأ عبر حقن في الوريد الذيلي. وأخيرًا، تُجمع عينة دم من الفأر الذي أجريت له عملية الزرع وتُحلل بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقدير مدى تكامل نخاع العظم.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التشعيع الكامل للجسم في إمكانية تحقيق درجة عالية من خلو نخاع العظم دون التعرض للتأثيرات السامة للخلايا المصاحبة للتشعيع الكامل للجسم، ودون الحاجة إلى مرافق ومعدات متخصصة. ولا تسمح هذه الطريقة بفهم تراكم الخلايا المشتقة من نخاع العظم في الجهاز العصبي المركزي فحسب، بل يمكن استخدامها أيضاً لدراسة موضوعات بحثية مثل تطور السلالة المكونة للدم، والبيولوجيا المناعية، وسرطان الدم. لتهيئة الفئران المستقبلة، قم بتحضير busulfan المخفف وفقاً للبروتوكول المكتوب، واستخدم الحقن داخل الصفاق (IP) لإعطاء 20 milligrams per kilogram للفئران المستقبلة يومياً.

بعد القتل الرحيم للفئران وفقاً للإرشادات المؤسسية، وبداخل غطاء تدفق هوائي صفيحي، يتم رش الفأر بـ 70%ethanol. يتم رفع الجلد عند منطقة البطن، وباستخدام مقص جراحي، يتم إجراء شق عبر الجلد من التجويف البطني صعوداً عبر الساق باتجاه الكاحل مع تثبيت القدم. يتم سحب الجلد بقوة من الكاحل باتجاه الورك، مما يؤدي إلى كشف أنسجة الساق.

قم بإزالة العضلات والدهون من عظمة الفخذ لكشف مفصل الورك مع سحب القدم برفق. لبسط الساق، اضغط بالمقص مقابل عظام الحوض، واقطع فوق رأس عظمة الفخذ مباشرةً، مع الحرص على عدم قطع عظمة الفخذ نفسها. وللمساعدة في الحفاظ على التعقيم، أمسك الساق من القدم ونظف أي أنسجة متبقية من عظمة الفخذ باستخدام المقص وأنسجة معقمة بالـ autoclave لفرك سطح العظم.

افصل عظمة الفخذ عن عظمة الظنبوب عن طريق القطع عبر مفصل الركبة، ثم ضع عظمة الفخذ في طبق زرع يحتوي على PBS واحضنها على الثلج. بعد ذلك، قم بإزالة عظمة الشظية والتخلص منها عن طريق القطع عند نقاط اتصال الشظية بالظنبوب. ثم قم بتنظيف عظمة الظنبوب.

قم بإزالة القدم عن طريق قطع عظمة الظنبوب (tibia) عند نهاية النخاع الأحمر، ثم ضع الظنبوب في طبق الزرع مع عظمة الفخذ (femur) واتركهما في الحضانة على الثلج. استخدم الملقط للإمساك بعظمة الفخذ، وباستخدام مقص جراحي، قم بكشط النهايات البعيدة للعظمة بعناية. أزل أقل قدر ممكن من العظم بما يكفي للكشف عن التجويف النخاعي باستخدام 3 mL من محلول PBS المعقم.

املأ سرنجة وثبّت بها إبرة عيار 23. أدخل الإبرة بعناية في التجويف النخاعي ثم اغسل نخاع العظم في طبق زراعة معقم. استخدم سن الإبرة لكشط التجويف النخاعي لضمان إزالة جميع الخلايا المطلوبة بعد عملية الاستخراج.

تأكد من أن نخاع العظم الأحمر لم يعد مرئياً وأن العظمة تظهر الآن باللون الأبيض. استخدم الملاقط لإمساك عظمة الظنبوب، وبواسطة مقص جراحي، قم بكشط الطرف الذي كانت تتصل فيه عظمة الظنبوب بالركبة بعناية. وللكشف عن التجويف النخاعي، املأ حقنة بـ 3 mL من محلول PBS المعقم وثبّت إبرة بقياس 25 gauge.

أدخل الإبرة بعناية في التجويف النخاعي واغسل نخاع العظم في الطبق الذي يحتوي على نخاع العظم المجمع من عظام الفخذ. وباستخدام طرف ماصة سعة 1 ml، قم بتفتيت نخاع العظم برفق لفصل الخلايا. مرر معلق الخلايا عبر مرشح سلة مسامي بمقاس 40 micron في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 ml.

استخدم PBS لشطف الطبق لاستعادة أي خلايا متبقية، وانقل المحلول المنظم عبر المرشح إلى أنبوب الطرد المركزي. أضف PBS إلى الأنبوب ليصل الحجم النهائي إلى 30 إلى 40 milliliters، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 450 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه.

أعد تعليق الراسب باستخدام 3 mL من منظم تحلل كريات الدم الحمراء وحضنه على الثلج لمدة 8.5 دقائق. بعد ذلك، أضف حوالي 30 mL من محلول PBS المعقم لإيقاف مفعول منظم التحلل، ثم قم بالطرد المركزي وتخلص من supernatant. استخدم 1 mL من محلول PBS المعقم لإعادة تعليق الراسب واحفظه على الثلج.

قم بتخفيف كمية صغيرة من متجانس الخلايا باستخدام PBS واستخدم مقياس كريات الدم (hemo cytometer) لعد الخلايا. خفف معلق الخلايا ليصل إلى 8 × 10⁶ خلية لكل milliliter واحفظه في الثلج حتى موعد الحقن. ولإجراء عملية زراعة نخاع العظم، أضف 300 µL من معلق الخلايا المخفف إلى محقنة سعة 0.5 milliliter.

بالنسبة لكل فأر سيتم حقنه، تأكد من إزالة أي فقاعات هوائية. ضع قفص الفئران المستقبلة المهيأة على وسادة تدفئة للسماح بتوسيع أوردة الذيل الجانبية. ضع فأراً مستقبلاً في جهاز تقييد مناسب الحجم، وامسح الذيل بقطعة شاش جراحية مبللة بـ 70%ethanol، ثم أمسك الذيل بإحكام وأدخل الإبرة برفق في أحد أوردة الذيل الجانبية مع توجيه الشطبة للأعلى، ثم احقن معلق الخلايا.

ثبّت شاشاً جراحياً على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. قبل نقل الفأر إلى قفص نظيف جديد، بعد حوالي أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من عملية زراعة نخاع العظام، ضع الفأر في أنبوب تقييد وقم بحلاقة الفراء عن الساق الخلفية للكشف عن الوريد الصافن الجانبي. بعد ذلك، ضع طبقة رقيقة من الفازلين على الساق واستخدم إبرة قياس 25 gauge لثقب الوريد الصافن باستخدام أنبوب شعري مطلي بالهيبارين.

اجمع حوالي 50 µL من الدم، ثم استخدم شاشاً جراحياً لوقف النزيف. وبمجرد توقف النزيف، أعد الفأر إلى القفص. أضف الدم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 mL من محلول fax buffer.

امزج الأنبوب عن طريق القلْب واحفظه على الثلج، ثم قم بمركزة عينات الدم عند 900 ×g لمدة خمس دقائق. بعد إزالة السائل الطافي والتخلص منه، استخدم 500 µL من محلول تحلل كريات الدم الحمراء لإعادة تعليق الراسب، واتركه في الحاضنة على الثلج لمدة 8.5 دقائق. بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول fax المنظم لإيقاف مفعول محلول التحلل، ثم قم بالمركزة عند 900 ×g لمدة خمس دقائق.

بعد إجراء عملية التحلل والتدوير لمرة ثانية، وفقاً لبروتوكول النص، تأكد من أن الراسب أصبح الآن أبيض اللون. إذا كان أحمر اللون، كرر خطوة التحلل للمرة الثالثة. قم بتعليق الراسب في fax buffer واستخدم قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) لتقدير نسبة الخلايا الموجبة لـ GFP.

يوضح هذا الرسم البياني مستويات الخيمرية (chimerism) التي تم قياسها أسبوعياً في الدم المحيطي للفئران التي خضعت لتهيئة بجرعة 100 milligrams per kilogram من busalan وتلقت زراعة ناجحة لنخاع العظم المتماثل جينياً (syngeneic)، والفئران التي خضعت لتهيئة بجرعة 80 milligrams per kilogram من busalan وتلقت زراعة غير ناجحة لنخاع العظم الخيفي (allogeneic). عادةً ما يتم ترسيخ مستويات الخيمرية الأعلى من 80% خلال ثلاثة إلى أربعة أسابيع بعد زراعة نخاع العظم؛ والبيانات المعروضة هنا هي بيانات تمثيلية للدم المحيطي تظهر نجاح وفشل زراعة نخاع العظم بعد ثلاثة أسابيع من العملية. وتظهر بيانات قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) هذه أن درجة عالية من الخيمرية تظل مستقرة لمدة عام واحد على الأقل في نخاع العظم، وأن التهيئة باستخدام الناقل (vehicle) ليست كافية لتحفيز الخيمرية في نخاع العظم.

بينما لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات استئصال نخاع العظم التي تم تحقيقها باستخدام جرعات من 60 إلى 100 مليجرام لكل كيلوجرام من busulfan، فإن الخلايا الموجبة لـ GFP تتراكم داخل الجهاز العصبي المركزي بطريقة تعتمد على الجرعة. يوضح هذا الشكل تراكم الخلايا المشتقة من نخاع العظم والموجبة لـ GFP داخل المنطقة القطنية من الحبل الشوكي في فأر من النوع البري، وبدرجة أكبر في نموذج فأر مصاب بمرض التصلب الجانبي الضموري، وهو مرض تنكس عصبي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام فئران مستقبلة ومنحَة متماثلة جينياً ومن نفس الجنس لتقليل احتمالية رفض الطعم بعد هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي والكيمياء النسيجية المناعية لدراسة الآليات التي تدخل من خلالها الخلايا المشتقة من نخاع العظم إلى الجهاز العصبي المركزي.