عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و فيفو السابقين زراعة الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا التائية المقيمة في الجلد بكفاءة عن خزعات جلد الإنسان. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على خزعات من جلد الإنسان باستخدام خزعة مستديرة. بعد ذلك ، يتم تقطيع كل خزعة جلدية إلى أربع قطع أصغر في طبق بتري.

بعد ذلك ، يتم فصل أنسجة الجلد ميكانيكيا وإنزيميا لإنتاج معلق خلية واحدة. أخيرا ، يتم تحليل الخلايا الليمفاوية المقيمة في الجلد عن طريق القياس الخلوي المتدفق وزراعة خارج الجسم الحي. في النهاية ، يمكن عزل أعداد كافية من الخلايا الليمفاوية المقيمة في جلد الإنسان وتحليلها عن طريق التلوين المناعي وتحليل FACS.

ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الأمراض الجلدية ومناعة أورام الجلد. على سبيل المثال ، كيف تساهم الخلايا التائية المقيمة في الجلد في المرض. سيوضح الإجراء Xuehui He ، طالب دكتوراه من مختبرنا.

بعد تحضير وسط الاستزراع ، وفقا لبروتوكول النص ، أضف ملليلترين من الوسط الكامل إلى ثلاثة آبار من لوحة ثقافة معقمة من ستة آبار. بعد ذلك ، استخدم خزعة دائرية بأربعة ملليمترات للحصول على خزعة من الجلد. ضعه في وسط استزراع RPMI 1640 الكامل واتركه على المقعد لمدة تصل إلى أربع ساعات ، أو عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

أثناء احتضان الخزعة ، قم بتسمية أنبوب تفكك أزرق الغطاء وأضف خمسة ملليلتر من وسط الثقافة الكامل. بعد ذلك ، استخدم أدوات معقمة لوضع الخزعة في البئر الأول لشطفها. انقل الأنسجة إلى البئر الثاني ، واشطفها ، ثم كرر العملية مرة أخرى في البئر الثالث.

انقل خزعة الجلد المغسولة جيدا إلى طبق بتري معقم وماصة 100 ميكرو لتر من وسط الثقافة الكامل فوق العينة. بعد ذلك ، استخدم مشرطا معقما يمكن التخلص منه من الفولاذ المقاوم للصدأ لكشط الأنسجة الدهنية تحت الجلد بعناية. في طبق بتري معقم طازج ، قم بتقطيع كل خزعة من الجلد إلى أربع قطع أصغر.

ثم انقل العينات إلى أنبوب التفكك المحضر الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من الوسط الكامل. قم بتغطية الأنبوب بإحكام وإرفاقه رأسا على عقب على غلاف مفكك الأنسجة الآلي. تأكد من أن جميع مواد العينة موجودة في منطقة الدوار.

بعد ذلك ، ابدأ عملية التفكك عن طريق تشغيل البرنامج M الطحال صفر واحد. لفصل الخزعة بسرعة الدوران المناسبة لمدة 56 ثانية. بعد المعالجة ، افصل أنبوب التفكك عن المفكك وتأكد من جمع جميع المواد المنفصلة في الجزء السفلي من الأنبوب.

أضف 150 لترا صغيرا من الكولاجين واحد A إلى أنبوب التفكك واحتضن العينة في حمام مائي مهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ثم أضف 100 لتر ميكرو من DNase إلى أنبوب التفكك واخلطه جيدا. قم بتوصيل أنبوب التفكك بغلاف جهاز فصل الأنسجة الآلي وقم بتشغيل برنامج M sallen zero one لفصل الخزعة مرة أخرى.

بعد ذلك ، ضع مصفاة خلايا نايلون صغيرة 70 على الجزء العلوي من أنبوب صقر سعة 50 مليلتر وقم بتطبيق مواد العينة المنفصلة على مصفاة الخلية لإزالة كتل الخلايا وبقايا الأنسجة. استخدم خمسة ملليلتر من الوسط الكامل لغسل مصفاة الخلية مرة واحدة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمرشح عند 450 جم و 20 درجة مئوية ، زائد أو ناقص درجتين لمدة 10 دقائق قبل شفط المادة الطافية.

بعد تكرار خطوة الغسيل مرة أخرى ، استخدم 300 لتر ميكرو من وسط الثقافة الكامل لإعادة تعليق منصات الخلايا. معلقات الخلية الواحدة جاهزة الآن لمزيد من التحليل. لإجراء تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا ، استخدم PMA و ionomysin و brefeldin A لتحفيز الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات قبل إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.

لإجراء التنشيط متعدد النسيلة للخلايا التائية المقيمة في الجلد ، قم بنقل 100 لتر ميكرو من معلق الخلية المفردة في صفيحة 96 بئر مستديرة. أضف الميكروبيدات المضادة ل CD3 ، المضادة ل CD28 ، السيتوكين البشري المؤتلف ، IL-2 و IL-1B. مع غطاء وزن جيد ، قم بتغطية لوحة الثقافة واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، و 100٪ رطوبة.

ثم ، عندما يتحول لون الوسط إلى اللون الأصفر ، قم بتغييره. يمكن ملاحظة مستعمرة خلية صافية في اليوم الثامن في زراعة الخلايا. لإجراء تحليل FACS ، قم بنقل الخلايا ذات الأهمية إلى لوحة بئر قاع V 96.

جهاز طرد مركزي عند 450 جم و 20 درجة مئوية ، زائد أو ناقص درجتين لمدة دقيقتين. ثم استنشق المادة الطافية. استخدم 100 لتر ميكرو من قابلية الفلورسنت 780 المترافقة القابلة للإصلاح للصبغ لتلطيخ الخلايا عن طريق الحضانة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم أضف 100 لتر ميكرو من المخزن المؤقت FACS وجهاز الطرد المركزي قبل شفط المادة الطافية. بعد ذلك ، بعد تحديد الأجسام المضادة أحادية النسيلة لعلامة سطح الخلية من القائمة الواردة في بروتوكول النص ، استخدم المخزن المؤقت FACS لتحضير محاليل الأجسام المضادة. استخدم التحكم في النظائر للأجسام المضادة مع عينة غير ملطخة لتحديد إعدادات البوابة.

الآن ، أضف 25 لترا صغيرا من خليط الأجسام المضادة للفأر المحضر في كل بئر واحميها من الضوء. احتضن عند 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف 100 لتر ميكرو من عازلة FACS ، وأجهزة الطرد المركزي ، وشفط المادة الطافية.

باستخدام المخازن المؤقتة المعدة لتلوين foxp3 وفقا لبروتوكول النص ، أضف 100 ميكرو لتر من التثبيت والمخزن المؤقت للنفاذية لإعادة تعليق المنصات. تخلط جيدا وتحتضن على أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 100 لتر ميكرو من مخزن النفاذية إلى كل بئر وجهاز طرد مركزي قبل شفط المادة الطافية.

بعد غسل الخلايا مرة أخرى واختيار الأجسام المضادة الصحيحة ، أضف 20 لترا صغيرا من خليط الأجسام المضادة أحادية النسيلة المحضر في كل بئر واحميها من الضوء قبل الحضانة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام المخزن المؤقت للنفاذية ، اغسل الخلايا مرة أخرى. بعد ذلك ، استخدم 110 لترات ميكرو من المخزن المؤقت FACS لإعادة تعليق المنصات ونقل معلقات الخلية إلى أنابيب mico FACS.

أخيرا ، إذا كان الرقم الدقيق للخلية مطلوبا ، عند 10 لترات ميكرو من تعليق موحد مختلط جيدا من فلوروسفير لكل عينة مباشرة قبل أخذ قياسات FACS. كما هو موضح هنا ، تم تحديد أنواع مختلفة من الكريات البيض الإيجابية CD45 في معلقات الخلية المفردة المشتقة من جلد الأفراد الأصحاء. بما في ذلك الخلايا التائية الإيجابية CD4 والخلايا التائية الإيجابية CD8 والخلايا التغصنية الإيجابية CD11c.

في حين لوحظ عدد قليل من الخلايا البائية أو الخلايا القاتلة الطبيعية أو العاثيات الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح المنهجية بتحليل الخلايا الإيجابية CD4 CD25 إيجابية foxp3 في خزعات جلد الإنسان. على سبيل المثال ، باستخدام التلوين داخل الخلايا بعد التثبيت والنفاذية ، من الممكن إثبات التعبير عن عامل النسخ foxp3 في الخلايا التائية الإيجابية CD25.

كما هو موضح هنا ، لتجنب التألق التلقائي في الخلفية ولتجنب خلايا الفلورسنت التلقائية ، يوصى باستخدام الجسم المضاد للفأر CD45 المضاد للإنسان المقترن بفلوروكروم 421 العنيف اللامع لبوابات الخلايا الليمفاوية. يوضح هذا الشكل أن غالبية الخلايا المقيمة في جلد الإنسان كانت خلايا تائية إيجابية CD3. لتحليل بقاء الخلية ، يوصى باستخدام صبغة قابلة للإصلاح للتمييز بين الخلايا القابلة للحياة والخلايا الميتة أو المحتضرة.

لمزيد من التحليل الوظيفي ، باستخدام خزعة جلدية واحدة بأربعة ملليمترات من الجلد الآفة من مرضى الصدفية ، تبين أن الخلايا التائية المشتقة من الخزعة أنتجت IL-17a و inteferon gamma. بعد تحفيز لمدة أربع ساعات باستخدام PMA ionomycin في وجود brefeldin A. أخيرا ، يوضح هذا الشكل أن الخلايا التائية من الأفراد النفسيين لديها قدرة أعلى بكثير على إنتاج السيتوكينات المرتبطة بالصدفية IL-17a والإنترفيرون جاما. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية والعوامل المختبرية يمكن أن يكون خطيرا.

ضع دائما تدابير السلامة في الاعتبار.