جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء مكافئ للجلد ثلاثي الأبعاد بسماكة كاملة ، والذي يشبه الجلد الطبيعي وتوليد جروح دقيقة وقابلة للتكرار في ظل ظروف معقمة باستخدام جهاز جرح آلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضمين الخلايا الليفية الجلدية البشرية الأولية أولا في هيدروجيل الكولاجين واحد. بعد ذلك ، تجلس الخلايا الكيراتينية للبشرة البشرية الأولية على الجزء العلوي من الهيدروجيل المطلي بالفيبرونيكتين.

ثم يتم زراعة النموذج في ظل ظروف مغمورة ، ثم تحت واجهة سائل الهواء ، يتم تشكيل مكافئ جلدي ثلاثي الأبعاد بسماكة كاملة ، يتكون من مكون جلدي وبشرة متعددة الطبقات. أخيرا ، يتم إنشاء جرح موحد في بيئة معقمة. في النهاية ، يتم استخدام التلوين الكيميائي المناعي والفحص المجهري لتقييم التركيب النسيجي لمكافئ الجلد المجرب بسماكة كاملة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية ، مثل النماذج الحيوانية ، على سبيل المثال ، هي أن مكافئ الجلد الكامل يتكون من خلايا بشرية أولية. لذلك جنبا إلى جنب مع جهاز الجرح الآلي ، يمكننا إنشاء جروح موحدة ، لذلك يمكن لجهاز الجرح الآلي أن يوفر نظرة ثاقبة لعمليات التئام الجروح الجلدية في بيئة إنسانية. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمتنا مثل هندسة أنسجة العظام.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتئام الجروح ، مثل العمليات البيولوجية ، وإصلاح الجلد الأساسي ، والحديث الخلوي بين مكون البشرة والجلد. للبدء ، قم بإذابة الكولاجين مع 0.1٪ حمض الخليك إلى تركيز نهائي يبلغ ستة ملليغرام لكل ملليلتر. قم بإعداد محلول تحييد الجل عن طريق خلط 232.5 مل من اثنين من X dmm ، و 7.5 مل من FCS ، و 7.5 ، ملليلتر من ثلاثة ملليغرام ، و 2.5 ملليلتر من خمسة ملليغرام لكل مليلتر.

تضع كبريتات شوندروتن إدخالات في آبار صفيحة 24 بئر ، وتفصل الخلايا الليفية الجلدية البشرية أو HDFS وتقوم بالطرد المركزي لمعلقات الخلية لمدة خمس دقائق. عند 270 جيجابايت ، قم بحساب الخلايا وجهاز الطرد المركزي Eloqua من 1 ، 200 ، 000 HDF لمدة خمس دقائق. عند 270 جم ، قم بإزالة snat واستخدم أربعة ملليلتر من محلول تحييد الهلام المبرد لإعادة تعليق HDF بعناية دون التسبب في فقاعات الهواء.

ثم أعد تعليق المحلول بثمانية ملليلتر من محلول الكولاجين. بعد ذلك ، استخدم ماصة متعددة الخطوات وأضف 500 ميكرولتر من خليط خلايا الكولاجين إلى كل إدخال. في صفيحة 24 بئر ، احتضن المواد الهلامية لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح للمواد الهلامية بالتصلب.

ثم استخدم ملليلترين من DMM بالإضافة إلى 10٪ FCS لكل بئر. لغمر المواد الهلامية ، احتضن المواد الهلامية لمدة 24 ساعة. استخدم الماء عالي النقاء لإذابة بروتين الفبرونيكتين البشري إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام لكل ملليلتر.

بعد احتضان المواد الهلامية المكافئة للجلد لمدة 24 ساعة ، قم بإزالة الوسط. استخدم 25 ميكرولترا من محلول الفيبرونيكتين لتغطية كل مكافئ جلدي واحتضان المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بإعادة تعليق البشرة البشرية أو الخلايا الكيراتينية أو HKS مع kgm اثنين بالإضافة إلى 5٪ FCS إلى تركيز نهائي من 1 مليون خلية لكل لتر بذرة ، 100 ، 000 هيك فوق كل هلام.

ثم احتضان المواد الهلامية لمدة 45 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق باستخدام kgm اثنين جاهز بالإضافة إلى 5٪ FCS غمر الخلايا ومواصلة الحضانة. بعد الحضانة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام ، استبدل الوسيط ب 2٪ FCS متبوعا باستبدال متوسط بدون FCS ، بعد يومين إلى ثلاثة أيام. اليوم السابع ، قم بإزالة الوسيط تماما.

استخدم ملقطا معقما لوضع كل ملحق في بئر واحد من ستة آبار. ثم أضف 1.5 مل من وسط النقل الجوي لكل بئر. مع الحرص على عدم تبليل سطح FTSC.

قم بتغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام لمدة 14 يوما إضافية. قم بإعداد جهاز الجرح الآلي باستخدام 70٪ من الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية لتطهير منطقة العمل باستخدام ملقط معقم. ضع مكافئات الجلد في مناطق مخصصة من لوحة حامل عينة الأوتوكلاف.

ضع عينة من لوحة الناقل في المقبس أسفل رأس الحفر. استخدم برنامج التحكم لتعيين معلمات الجرح على النحو التالي. سرعة الدوران 15 ، 000 دورة في الدقيقة اختراق ، 1.5 ملم.

الدفع 100 هرتز. انقل معلمات الجرح إلى جهاز الجرح الآلي. ابدأ عملية الجرح عند اكتمالها.

قم بإزالة لوحة حامل العينة من المقبس واستخدم ملقطا معقما لنقل FTSE الجريح مرة أخرى إلى الملحق المستخدم في الزراعة. احتضان FTSE الجريح حتى التقييم التجريبي. استخدم النماذج لتحليله النسيجي في أي وقت.

تميزت HDFS و HKS المعزولة بتلطيخ كيميائي مناعي قبل استخدامها في FTSE. HDF إيجابية للمينتون ، وهي علامة للأرومات الليفية HEK الأولية التي تعبر بدرجة عالية عن بروتين التمايز المبكر CYTOKERATIN 14 ، ولكن لا يوجد تقريبا بروتين تمايز الخلايا الكيراتينية المتأخرة CYTOKERATIN 10. تم استزراع FTSE لمدة سبعة أيام في ظروف متوسطة مغمورة ، تليها 14 يوما في واجهة سائل الهواء.

خلال هذه العملية ، تتعاقد FTSC بشكل كبير في غضون 21 يوما. تتكاثر HEK عن طريق تغيير المستوى المتوسط بحيث يتعرض سطح النماذج للهواء. ومن خلال زيادة تركيز الكالسيوم ، يتم تحفيز HKS على التمايز إلى بشرة متعددة الخلايا تتكون من عدة طبقات خلوية حيوية من الخلايا الكيراتينية.

في حالات مختلفة من التمايز D والقرنية الأذينية. بمقارنة تلطيخ الهيماتين واليوزين في FTSE مع جلد الإنسان الأصلي ، يصبح من الواضح أن FTSE يحاكي العمارة النسيجية للجلد. يمكن تلطيخ HDF الموجود في الكولاجين واحد هيدروجيل بالأجسام المضادة الأولية ضد الفيمنتين.

بالإضافة إلى ذلك ، تشكل الخلايا الكيراتينية طبقة بشرة تتكون من السيتوكيراتين 14 خلية إيجابية وعلامة التمايز المتأخرة. يتم التعبير عن السيتوكيراتين 10 في الطبقات القاعدية الفائقة. علاوة على ذلك ، فإن St.Stratum cornium إيجابي ل RIN بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض الجلدية لاستكشاف التئام الجروح الجلدية والإعداد الموحد في المختبر الذي يحاكي جلد الإنسان عن كثب.