طرق للتميز الرئيسين تطوير بيوفيلم والموئل التجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف تفاعلات الأغشية الحيوية مع البيئة المحيطة باستخدام طرق متكاملة للقيام بذلك. يتم إنشاء نظام خلية تدفق الموائع الدقيقة ذات المدخل المزدوج حيث يتم ضخ الوسائط المحتوية على الجلوكوز والخالية من الجلوكوز عبر خلية تدفق تولد تدرجا للجلوكوز. تضاف البكتيريا إلى النظام ويسمح للأغشية الحيوية بالتطور على مدار عدة أيام.

ثم يتم تصوير الأغشية الحيوية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ثلاثي الأبعاد لتوصيف النقل الانفرادي. داخل الأغشية الحيوية ، يتم حقن متتبعات الفلورسنت في نظام التدفق ويتم إجراء التصوير بفاصل زمني لتوصيف مجال التدفق حول مستعمرات الأغشية الحيوية ، ويتم حقن الميكروبيدات الفلورية وإجراء التصوير بفاصل زمني. يوضح تحليل النقل المذاب وتتبع الجسيمات للبيانات الناتجة فائدة هذه الطريقة في تقييم عمليات الأغشية الحيوية في ظل بيئات كيميائية مختلفة داخل جهاز واحد وفي مجموعة واحدة من التجارب.

الميزة الرئيسية لهذه الأساليب هي أنها تسمح بالتقييم المتزامن لجوانب متعددة من تفاعلات بيئة الأغشية الحيوية. يمكن أن تساعد الطرق المذكورة هنا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تكوين الأغشية الحيوية في البيئات الطبيعية أو في الالتهابات المرتبطة بالغشاء الحيوي. العمل في غطاء التدفق الصفحي ، ونقل مستعمرة من posa PAO ، وواحد GFP ، وإنهاء مستعمرة من e coli DH خمسة ألفا من لوحة LB إلى أنابيب منفصلة تحتوي على ثلاثة ملليلتر من مرق رطل.

احتضن الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة. يعتمد نظام التدفق هذا على خلية موائع دقيقة مزدوجة المدخل تسهل مراقبة نمو الأغشية الحيوية تحت تدرج كيميائي محدد جيدا يتكون من خلط محلولين داخل غرفة التدفق. أثناء التدفق ، يتم تشكيل تدرج تركيز سلس في الاتجاه العرضي.

نتيجة للانتشار ، يكون ملف التركيز شديد الانحدار بالقرب من المدخل وأكثر استرخاء في اتجاه مجرى النهر. في يوم التجربة ، قم بتجميع نظام التدفق بعناية. أولا ، قم بتثبيت الأنبوب في المضخة التمعجية ، ثم قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب بزجاجة متوسطة تحتوي على 900 مل من وسط FAB مع الجلوكوز ، والطرف الآخر بمصيدة فقاعات.

كرر هذه العملية لتوصيل زجاجة متوسطة ثانية تحتوي على 900 مل من الفاب بدون جلوكوز بمصيدة فقاعات ثانية. بعد ذلك ، أدخل الصمامات ثلاثية الاتجاهات قبل مداخل خلية التدفق مباشرة وقم بتوصيل كل مصيدة من مصائد الفقاعات بخلية التدفق. أخيرا ، قم بتوصيل مخرج خلية التدفق بزجاجة نفايات.

تأكد من وضع خلية التدفق مع وضع جانب انزلاق الغطاء لأسفل للسماح للخلايا العالقة بالاستقرار على زلة الغطاء. بعد تجميع نظام التدفق ، قم بتشغيل المضخة التمعجية بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الساعة لكل مدخل لملء النظام مع إدخال وسيط المصنع المتوسط إلى المدخلين مع الجلوكوز المقدم في مدخل واحد فقط. بعد ذلك ، عند العمل في غطاء المحرك ، قم بتخفيف المزرعتين البكتيريتين إلى نسبة واحد إلى واحد في واحد من الماء المعقم مع ما يعادل OD 600 من 0.01 لكل بكتيريا لتلقيح خلية التدفق ، واستخدم حقنة بلاستيكية معقمة لحقن 500 ميكرولتر من اللقاح في كل من مداخل خلايا التدفق عبر الصمام ثلاثي الاتجاهات.

بعد الحقن ، أوقف المضخة واترك الخلايا البكتيرية تلتصق بزجاج الغطاء لمدة ساعة واحدة بعد توصيل الخلايا ، واضبط المضخة على 0.03 مل في الدقيقة لكل مدخل واسمح للنظام بالتدفق لمدة ثلاثة أيام في درجة حرارة الغرفة يتطور خلالها الأغشية الحيوية تحت تدرج التعرض للجلوكوز. بعد مرور ثلاثة أيام. استخدم علامة ومسطرة لرسم شبكة على الجانب الزجاجي للغطاء من خلية التدفق استعدادا للتصوير.

سيساعد هذا في تحديد مناطق التصوير لمواجهة البقع لعرض الإشريكية القولونية. أولا ، أطفئ الأضواء لتغميق منطقة العمل لأن البقعة المضادة حساسة للضوء. استخدم حقنة لحقن مليلتر واحد من صبغة الحمض النووي الفلوري الأحمر المخفف ببطء في الصمام ثلاثي الاتجاهات في المنبع من غرفة التدفق.

أوقف التدفق. حافظ على راكدة خلية التدفق في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد مرور 30 دقيقة.

استأنف التدفق بمعدل 0.03 مل في الدقيقة واغسل البقعة غير المنضومة لمدة 15 دقيقة. ثم أوقف التدفق وراقب الأغشية الحيوية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بهدف 63 ×. ابحث عن مجال رؤية يحتوي على كمية جيدة من الكتلة الحيوية مع مستعمرات الأغشية الحيوية المنفصلة جيدا كما هو موضح هنا.

ثم التقط مكدسات الصور ثلاثية الأبعاد في القنوات المناسبة لرسم خريطة للأنماط المكانية لتطور الأغشية الحيوية داخل صورة خلية التدفق ، والأغشية الحيوية على ثلاث مسافات طولية أو X أو أكثر على طول مدخل خلية التدفق ، وفي ثلاثة مواضع عرضية أو Y بالنسبة للتدرج الغذائي المفروض عليها. لتوصيف أنماط النقل المنفردة داخل الأغشية الحيوية ، ابدأ بخلية التدفق. بعد ثلاثة أيام من تطوير الأغشية الحيوية ، مرة أخرى ، العمل في الظلام.

أوقف المضخة لإيقاف التدفق مؤقتا ، وافتح مصائد الفقاعات لتحرير ضغط الحقن. ثم استخدم حقنة لحقن مليلتر واحد من محلول تتبع الخيال العلمي المخفف في أي من الصمامات ثلاثية الاتجاهات في أعلى خلية التدفق. بعد حقن محلول الخيال العلمي ، أغلق مصائد الفقاعات.

اضبط الصمام ثلاثي الاتجاهات وأعد تشغيل المضخة بسرعة 0.03 ملليلتر في الدقيقة لتوصيل محلول الخيال العلمي إلى خلية التدفق. بعد ذلك ، قم بتبديل وضع التصوير متحد البؤر إلى XYT بمعدل إطارات 0.15 هرتز. يفضل استخدام دقة زمنية عالية للتعبير عن اختراق الصبغة ، ومع ذلك ، فإن المسح السريع يقلل من جودة الصورة.

لذا اضبط سرعة المسح ومتوسط الخط لتحقيق التوازن بين دقة الوقت للتصوير وجودة الصورة. بمجرد تعيين معلمات التصوير ، أعد تشغيل المضخة لاستئناف التدفق. بمعدل 0.03 مل في الدقيقة ، سيتم تسليم العلوم خمسة إلى خلية التدفق في وقت واحد.

بدء التصوير متحد البؤر بفاصل زمني. بمجرد اكتمال التصوير بفاصل زمني. تم إجراء تحليل الانتشار وفقا للتعليمات الواردة في المستند المصاحب.

لتوصيف مجال التدفق حول الأغشية الحيوية ، قم بتخفيف ميكروبيدات الفلورسنت بمتر واحد في الماء المعقم إلى تركيز صلب نهائي قدره 0.2٪ وحجم نهائي قدره 0.5 ملليلتر. ثم دوامة للتأكد من أن الميكروبيدات مشتتة جيدا ، أوقف التدفق مؤقتا ثم حقن وتسليم الميكروبيدات الفلورية المخففة في خلية التدفق. كما كان من قبل ، قم بتغيير معدل التدفق إلى 0.01 مل في الساعة.

يسمح معدل التدفق المنخفض بالتتبع الدقيق لمسار الجسيمات. قم بتبديل الإعدادات متحد البؤر إلى وضع XYT واطلب من البرنامج تتبع حركة الجسيمات في شريحة Z واحدة. التقط صور السلسلة الزمنية كما كان من قبل باستخدام معدل إطارات واحد هرتز.

كرر إجراء حقن الجسيمات والصورة في مواقع Z المختلفة. بعد الانتهاء من التصوير ، اتبع التعليمات الواردة في المستند المصاحب لحساب متجهات التدفق لدراسة التفاعلات البكتيرية في الأغشية الحيوية تحت تدرج الجلوكوز. تم تمييز Posa GFP و E coli في الأغشية الحيوية من الأنواع المزدوجة من خلال التلوين المضاد.

مع cyto ، تم الحصول على 62 صورة في كل منطقة من مناطق التصوير التسع في غرفة التدفق. في التراكبات الموضحة هنا ، يظهر posa GFP باللون الأخضر أو الأصفر ، ويظهر الإشريكية القولونية باللون الأحمر. سيطرت Posa على الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية في المناطق ذات التركيزات العالية من الجلوكوز والإشريكية القولونية التي تهيمن عليها المناطق ذات التركيزات المنخفضة من الجلوكوز.

وهكذا احتل النوعان منافذ بيئية متميزة. توضح هذه النتائج فائدة خلية تدفق الموائع الدقيقة ذات المدخل المزدوج في دراسة نشاط تطوير الأغشية الحيوية والتفاعلات في البيئات المعقدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام خلية تدفق السوائل الدقيقة ذات المدخل المزدوج لزراعة الأغشية الحيوية تحت التدرجات الكيميائية وكيفية الحصول على المعلمات البيئية لتطوير الأغشية الحيوية باستخدام حقن جزيئات الفلورسنت أو المطاردات بعد التطوير.

مهدت هذه الأساليب الطريق للباحثين في مجالات علم الأحياء الدقيقة البيئية والسريرية لاستكشاف التفاعلات المعقدة بين المجتمعات الميكروبية والبيئة المحيطة بها.