Biofunctionalized البروسية الأزرق النانوية الجزيئية لالمتعدد الوسائط تطبيقات التصوير

الهدف العام من هذا الإجراء هو تخليق جسيمات نانوية من أزرق بروسيا وظيفية بيولوجياً لاستخدامها كعوامل تصوير جزيئي متعدد الوسائط. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تخليق جسيمات نانوية من أزرق بروسيا تحتوي إما على أيونات الجادولينيوم أو المنجنيز، والتي تعمل على تعزيز إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). وتتمثل الخطوة الثانية في ربط الأفيدون الفلوري على سطح الجسيمات النانوية، مما يمنحها قدرة التصوير الفلوري.

بعد ذلك، يتم وظيفياً تحويل الجسيمات النانوية المغلفة بالأفادون حيوياً باستخدام الأجسام المضادة المبيوتينية المستهدفة للخلايا المطلوبة. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء فحص لمراقبة الجودة على الجسيمات النانوية المحولة حيوياً من خلال قياس حجمها وجهد زيتا واستقرارها الزمني. وفي النهاية، تُستخدم الجسيمات النانوية المحولة حيوياً في تطبيقات التصوير الجزيئي متعدد الوسائط لتصور مجموعة محددة ومستهدفة من الخلايا ضمن خليط باستخدام التصوير الفلوري والتصوير بالرنين المغناطيسي MRI.

عادةً ما تكون عوامل التصوير التجارية الحالية أحادية النمط وتوفر دقة على المستوى التشريحي فقط. تجمع جسيمات Prussian blue النانوية بين نمطين تكميليين للتصوير وهما التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتفلور، مما يسمح بالتصوير الجزيئي وعلى المستويات دون الخلوية. وتمتد تطبيقات الجسيمات النانوية متعددة الأنماط لتشمل تشخيص السرطان والأمراض الالتهابية، بالإضافة إلى مراقبة استجاباتها للعلاج.

يعود ذلك إلى أن الجسيمات النانوية الوظيفية بيولوجياً يمكنها استهداف والارتباط بمجموعة من الخلايا ضمن منطقة محددة من الجسم. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تشخيص السرطان والأمراض الالتهابية والاستجابة للعلاج، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على حالات مرضية أخرى ستستفيد من حساسية وخصوصية التصوير الجزيئي. وباستخدام الفلورة والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، تولدت لدينا الفكرة الأولى لإنتاج هذه الجسيمات النانوية عندما حددنا أن أزرق بروسيا (Prussian blue)، وهو عامل معتمد من إدارة الغذاء والدواء (FDA) للاستهلاك البشري عن طريق الفم، يمكن تخليقه بشكل مستقر باستخدام مخطط تخليق أحادي الخطوة، وتوظيفه بيولوجياً بقوة باستخدام تقنيات الاقتران البيولوجي القياسية.

للبدء، قم بتحضير محلول بتركيز 5 ميلي مولار من سداسي سيانو فيرات البوتاسيوم الثنائي في 5 مل من الماء منزوع الأيونات لتحضير المحلول A، ثم قم بتحضير المحلول B الذي يحتوي على 2.5 ميلي مولار من كلوريد الحديد الثلاثي و 2.5 ميلي مولار من كلوريد المنجنيز الثنائي في 10 مل من الماء منزوع الأيونات لتخليق جسيمات نانوية من أزرق بروسيا المنجنيزي. يمكن تخليق جسيمات نانوية أخرى كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. انقل المحلول B إلى دورق مستدير القاع وقم بتقليب المحلول بسرعة 1000 RPM في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام مضخة تمعجية، أضف المحلول A قطرة تلو الأخرى إلى الوعاء بمعدل 10 milliliters في الساعة. بعد اكتمال إضافة المحلول A، قم بتقليب الخليط بسرعة 1000 RPM لمدة 30 دقيقة إضافية. ثم انقل حصصاً حجمية مقدارها one milliliter من الخليط إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة وأضف 0.2 milliliters من كلوريد الصوديوم بتركيز five milli إلى كل أنبوب.

قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 20,000 ×g لمدة 10 دقائق على الأقل، ثم قم بإزالة السائل العلوي بعناية، مع ترك راسب الجسيمات النانوية. بعد ذلك، أضف 1 mL من الماء منزوع الأيونات إلى كل راسب. استخدم طرفاً دقيقاً (micro tip) لتعليق الجسيمات النانوية بشكل متجانس في المحلول عن طريق المعالجة بالموجات فوق الصوتية (sonication).

اغسل الجسيمات النانوية ثلاث مرات إضافية على الأقل لإزالة مكونات التفاعل الأولي من المعلق بعد عملية الطرد المركزي النهائية، ثم أعد تعليق الجسيمات النانوية في 1 mL من الماء منزوع الأيونات بعد طلاء الجسيمات النانوية بالصبغة الفلورية كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، وأخرج مخزونات الأجسام المضادة المبيوتنة من الثلاجة. استخدم anti neuron glial antigen 2 و anti-human eotaxin 3. انقل الجسم المضاد المبيوتن إلى مرشح أنبوب طرد مركزي من النايلون بمسامية 0.2 µm، ثم قم بإجراء الطرد المركزي للأنبوب عند 14,000 ×g لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، أضف كمية أقل من أو تساوي 0.05 milligram من الجسم المضاد لكل milligram من الجسيمات النانوية المغلفة بـ Aden، وقم بتغطية الأنابيب بورق الألومنيوم لحمايتها من الضوء. حضّن الأنابيب مع الرج الخفيف لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات عند درجة حرارة four degrees celsius. بعد ربط الأجسام المضادة، أضف 10 microliters من عينة الجسيمات النانوية بتركيز one milligram per milliliter إلى 990 microliters من الماء منزوع الأيونات في أنبوب بلاستيكي مخصص للاستخدام مرة واحدة، ثم أغلق الأنبوب ورجه للمزج.

بعد ذلك، قم بتحديد متوسط حجم الجسيمات النانوية باستخدام نظام تشتت الضوء الديناميكي بزاوية قياس تبلغ 173 درجة. ابدأ بتحضير معلقات من الخلايا في PBS بحجم 10 milliliter وبتركيز 100,000 خلية لكل milliliter تقريباً؛ وبالنسبة لأنابيب المزارع المختلطة التي تحتوي على نسب متفاوتة من كل خط خلوي، فيجب تحضيرها كما هو موضح في البروتوكول النصي، مع إضافة 2 milliliter من 5%BSA إلى كل أنبوب لحجب الخلايا وتقليل الارتباط غير النوعي. ثم أضف 1 milliliter من الجسيمات النانوية الوظيفية الحيوية بتركيز 1 mg/mL إلى كل أنبوب، واحضن الخليط لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، اشطف الخلايا للتخلص من الجسيمات النانوية غير المرتبطة عن طريق دوران الأنابيب بسرعة 1000 ×g لمدة خمس دقائق وإعادة تعليق الراسب في 1 مل من PBS. كرر هذه العملية مرتين إضافيتين على الأقل. ثبت الخلايا باستخدام 10% formaldehyde في PBS، ثم أضف 10 µg/mL من seven amino actin و mycin D في PBS لصبغ الخلايا، وحضن الأنبوب على الثلج لمدة 30 دقيقة، ثم اشطف الخلايا باستخدام PBS.

بعد ذلك، يتم تحميل العينة في جهاز قياس التدفق الخلوي وتحليل 10,000 خلية محددة من كل عينة. تم وصف إجراء مماثل لتصوير الخلايا المرتبطة بجسيمات نانوية فلورية باستخدام المجهر البؤري الليزري في البروتوكول النصي. للبدء، يتم تنمية الخلايا في دوارق T 75 حتى تصل إلى تقارب 80% تقريبًا، ثم تُشطف الخلايا لإزالة الوسط باستخدام خمسة ملليلتر من PBS.

أضف خمسة ملليلترات من 1%BSA في PBS وقم بحجب الخلايا لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف خمسة ملليلترات من الجسيمات النانوية المكسوة بالأجسام المضادة بتركيز 0.5 مليجرام لكل ملليلتر إلى الدورق واترك الخلايا في الحاضنة لمدة ساعة واحدة للسماح للجسيمات النانوية بالارتباط. ثم اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام خمسة ملليلترات من PBS لإزالة الجسيمات النانوية غير المرتبطة.

ثم أضف 2 mL من محلول trypsin EDTA بتركيز 0.25%، واحضن الخلايا لمدة 5 دقائق لفصلها عن القارورة. أضف 8 mL من DMEM لإيقاف مفعول التريبسين، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي. قم بتدويرها عند 1000 ×g لمدة 5 دقائق لترسيب الخلايا.

بعد ذلك، قم بشفط السائل العلوي وإعادة تعليق الخلايا في 1 ml من PBS. أضف 1 ml من formaldehyd 10% في PBS لتثبيت الخلايا، ثم انقل 100 µL من كل عينة إلى آبار منفصلة في طبق ذو قاع مسطح يحتوي على 96 بئراً. أضف 100 µL من 1% aros المذاب في ماء منزوع الأيونات إلى كل بئر واخلط عن طريق السحب والطرد باستخدام الماصة.

اترك الهلام ليتصلب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 12 ساعة لإنتاج نموذج محاكاة (phantom). بعد تصلب الهلام، ضع نموذج المحاكاة في مغناطيس سريري أفقي بقوة 3 T بجانب كتلة مكعبة صلبة بطول 150 centimeter من agar بتركيز 2%. ثم ثبت نموذج المحاكاة وكتلة agar في مركز ملف دماغي HD ثماني القنوات؛ ولقياس أزمنة الاسترخاء، استخدم مقاطع إكليلية بسمك 0.5 millimeter مأخوذة من منتصف ارتفاع الطبق ذو 96 بئراً. استُخدمت مقاييس تشتت الضوء الديناميكي لتحديد القطر الهيدروديناميكي للجسيمات النانوية المُنتجة، كما أكدت دراسات الاستقرار الاستقرار طويل الأمد للجسيمات النانوية المستخدمة في التجارب القائمة على الماء وتلك القائمة على الأوساط الخلوية.

أظهر مجهر كنفوكال الليزري أن الجسيمات النانوية الفلورية المحملة بالأجسام المضادة لـ EOT three ارتبطت تحديداً بسطح خلايا EOL one. وعند استخدام الأجسام المضادة لـ NG two، ارتبطت هذه الأخيرة تحديداً بسطح الكرات العصبية BSG. وقد تمكنت الجسيمات النانوية ذات الوظائف الحيوية من وسم مجموعة من الخلايا المستهدفة فلورياً بنجاح، وذلك وفقاً لما تم قياسه بواسطة قياس التدفق الخلوي.

علاوة على ذلك، تمكنت الجسيمات النانوية من استهداف مجموعة فرعية محددة من الخلايا ضمن خليط حتى عند انخفاض نسب الخلايا المستهدفة إلى الخلايا الضابطة. وأخيراً، أدت الجسيمات النانوية الوظيفية حيوياً إلى زيادة تباين التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) للخلايا المستهدفة، وهي الخلايا التي عولجت بجسيمات نانوية محملة بـ nng. وأظهر جسمان مضادان فرط كثافة في تسلسلات T one الموزونة مقارنة بالخلايا التي عولجت بجسيمات ضابطة.

في المقابل، منحت الجسيمات النانوية A NNG two شدة منخفضة (hypo intensity) في تسلسلات T two مقارنة بالجسيمات الضابطة. بمجرد إتقانها، يمكن إكمال تخليق جسيمات أزرق بروسيا النانوية الوظيفية بيولوجياً في غضون يومين إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح.

بشكل مماثل لهذا الإجراء، يمكن إكساب الجسيمات النانوية وظائف حيوية باستخدام بوليمرات حيوية مختلفة ورابط استهداف لاستقصاء أمراض وحالات جديدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تخليق جسيمات Prussian blue النانوية لتطبيقات الفلورة والتصوير من أجل وسم مجموعات من الخلايا. لا تنسَ اتباع إرشادات السلامة وإجراءات التشغيل القياسية بدقة عند إجراء الدراسات في مغناطيس MRI السريري.