Biofunctionalized البروسية الأزرق النانوية الجزيئية لالمتعدد الوسائط تطبيقات التصوير

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع الجسيمات النانوية الزرقاء البروسية الوظيفية الحيوية لاستخدام عوامل التصوير الجزيئي متعددة الوسائط. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع الجسيمات النانوية الزرقاء البروسية التي تحتوي إما على أيونات الجادولينيوم أو المنغنيز ، والتي تعزز إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي. الخطوة الثانية هي إرفاق أفادون الفلورسنت على سطح الجسيمات النانوية ، مما يمنح قدرة التصوير الفلوري.

بعد ذلك ، يتم تشغيل الجسيمات النانوية المطلية بأفادون حيويا مع الخلية المرغوبة التي تستهدف الأجسام المضادة الحيوية. تتمثل الخطوة الأخيرة في إجراء فحص لمراقبة الجودة على الجسيمات النانوية الوظيفية الحيوية عن طريق قياس حجمها وإمكانات زيتا واستقرارها الزمني. في النهاية ، يتم استخدام الجسيمات النانوية الوظيفية الحيوية في تطبيقات التصوير الجزيئي متعدد الوسائط لتصور مجموعة مستهدفة محددة من الخلايا داخل خليط باستخدام التصوير الفلوري والتصوير بالرنين المغناطيسي.

عادة ما تكون عوامل التصوير التجارية الحالية أحادية الوضع وتقدم دقة فقط على المستوى التشريحي. تجمع الجسيمات النانوية الزرقاء البروسية بين وضعين متكاملين للتصوير بالرنين المغناطيسي والتألق وتسمح بالتصوير الجزيئي والمستويات الخلوية الفرعية. تمتد تطبيقات الجسيمات النانوية متعددة الوسائط نحو تشخيص السرطان والأمراض الالتهابية بالإضافة إلى مراقبة استجاباتها العلاجية.

وذلك لأن الجسيمات النانوية الوظيفية الحيوية يمكن أن تستهدف وترتبط بمجموعة من الخلايا داخل منطقة محددة من الجسم. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتشخيص السرطان والأمراض الالتهابية والاستجابة للعلاج ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الحالات المرضية الأخرى التي ستستفيد من حساسية وخصوصية التصوير الجزيئي. باستخدام التألق والتصوير بالرنين المغناطيسي ، خطرنا لأول مرة فكرة إنتاج هذه الجسيمات النانوية عندما قررنا أن الأزرق البروسي والعامل المعتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية للاستهلاك البشري عن طريق الفم يمكن تصنيعه بثبات باستخدام مخطط توليف من جزء واحد وتشغيله حيويا بقوة باستخدام تقنيات الاقتران الحيوي القياسية.

للبدء ، قم بإعداد محلول 5 ملايين مولار من البوتاسيوم سداسي سانو ، وتخمير اثنين في خمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لصنع محلول الإصلاح التالي B الذي يحتوي على 2.5 ملليمولار من الحديد وثلاثة كلوريد و 2.5 مللي مولار. كلوريد في 10 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لتخليق الجسيمات النانوية الزرقاء البروسية المنغنيز. يمكن تصنيع الجسيمات النانوية الأخرى كما هو موضح في بروتوكول النص ، ونقل الحل B إلى A قارورة القاع المستديرة وتحريك المحلول عند 1000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام مضخة تمعجية إضافة محلول, A قطرة في الوعاء بمعدل 10 ملليلتر في الساعة. بعد اكتمال إضافة المحلول A ، قلب الخليط على 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة إضافية. ثم انقل مليلتر واحد من الخليط إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة وأضف 0.2 مل من خمسة مللي كلوريد الصوديوم إلى كل أنبوب.

الطرد المركزي الأنابيب عند 20 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق على الأقل ، ثم قم بإزالة supinate بعناية ، تاركا حبيبات الجسيمات النانوية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات إلى كل بيليه. استخدم طرفا صغيرا لتعليق الجسيمات النانوية بالتساوي في المحلول عن طريق الصوتنة.

اغسل الجسيمات النانوية ثلاث مرات أخرى على الأقل لإزالة مكونات التفاعل الأولي من التعليق بعد الدوران النهائي ، وأعد تعليق الجسيمات النانوية في مليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات بعد طلاء الجسيمات النانوية بعرين الفلورسنت كما هو موضح في بروتوكول النص ، وقم بإزالة مخزونات الأجسام المضادة الحيوية من الثلاجة. هنا. استخدم المستضد الدبقي المضاد للخلايا العصبية الثاني والإيوتاكسين المضاد للإنسان ثلاثة. انقل الجسم المضاد البيوتينيل إلى مرشح fuge دقيق من النايلون 0.2 ميكرو ، ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 14 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أضف أقل من أو يساوي 0.05 ملليغرام من الجسم المضاد لكل ملليغرام من الجسيمات النانوية المطلية بعدن وقم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء. احتضان الأنابيب مع الرج اللطيف لمدة ساعتين إلى أربع ساعات عند أربع درجات مئوية. بعد ربط الأجسام المضادة ، أضف 10 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر عينة من الجسيمات النانوية إلى 990 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في غطاء بلاستيكي يمكن التخلص منه من vete و V للخلط.

حسنا ، حدد متوسط حجم الجسيمات النانوية باستخدام نظام تشتت الضوء الديناميكي بزاوية قياس 173 درجة. ابدأ بإعداد معلقات 10 ملليلتر للخلايا في PBS بتركيز حوالي 100 ، 000 خلية لكل مليلتر للثقافات المختلطة ، يجب تحضير الأنابيب التي تحتوي على نسب متفاوتة لكل خط خلية كما هو موضح في بروتوكول النص عند ملليلترين من 5٪ BS ، A لكل أنبوب لمنع الخلايا وتقليل الارتباط غير المحدد. ثم أضف ملليلترا واحدا من ملليغرام واحد لكل مليلتر ، وقم بإضفاء الطابع الوظيفي الحيوي على الجسيمات النانوية لكل أنبوب ، واحتضان الخليط لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، اشطف الخلايا الخالية من الجسيمات النانوية غير المرتبطة عن طريق تدوير الأنابيب عند 1000 مرة G لمدة خمس دقائق وأعد ثني الكريات في مليلتر واحد من PBS. كرر هذه العملية مرتين أخريين على الأقل. قم بإصلاح الخلايا باستخدام 10٪ فورمالديهايد في PBS ثم أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر ، وسبعة أكتين أمينو وميسين D في PBS لتلطيخ الخلايا ، واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة ثم شطف الخلايا باستخدام PBS.

بعد ذلك ، قم بتحميل العينة في مقياس التدفق الخلوي وقم بتحليل 10 ، 000 خلية مسورة من كل عينة. يتم وصف إجراء مشابه لخلايا الصورة المرتبطة بجسيمات الفلورسنت النانوية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر في بروتوكول النص. للبدء ، ارتد الخلايا في قوارير T 75 إلى ما يقرب من 80٪ من التقاء ، ثم اشطف الخلايا الخالية من الوسط بخمسة ملليلتر من PBS.

أضف خمسة ملليلتر من 1٪ BSA في PBS وقم بحظر الخلايا لمدة ساعة واحدة. ثم أضف خمسة ملليلتر من 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من الجسيمات النانوية المطلية بالأجسام المضادة إلى القارورة واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة للسماح للجسيمات النانوية بالارتباط. بعد ذلك ، اشطف الخلايا ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من PBS لإزالة الجسيمات النانوية غير المرتبطة.

ثم أضف ملليلترين من 0.25٪ تريبسون في محلول EDTA ، واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا عن القارورة. أضف ثمانية ملليلتر من DMEM لإخماد الترين ثم انقل معلق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي. قم بتدويرها عند 1000 مرة G لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا.

بعد ذلك ، قم بشفط السوبينات وإعادة تعليق الخلايا في مليلتر واحد من PBS. أضف ملليلتر واحد من الفورمالديهايد بنسبة 10٪ في PBS لإصلاح الخلايا ثم انقل 100 ميكرولتر من كل عينة إلى آبار منفصلة من صفيحة قاع مسطحة 96 بئر. أضف 100 ميكرولتر من 1٪ aros المنصهرة في الماء منزوع الأيونات إلى كل بئر وخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

اسمح للهلام بالتصلب عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة لإنتاج وهم. بعد أن يصلب الجل ، ضع الشبح في مغناطيس سريري أفقي بثلاثة T بجوار كتلة مكعبة صلبة 150 سم من 2٪ أجار. ثم قم بتأمين كتلة الشبح والأجار داخل وسط ملف دماغي عالي الدقة ثماني قنوات لقياس أوقات الاسترخاء ، استخدم شرائح إكليلية بسمك 0.5 ملم تم التقاطها في منتصف ارتفاع لوحة البئر 96 تم استخدام فحوصات تشتت الضوء الديناميكي لتحديد القطر الهيدروديناميكي لاستقرار الجسيمات النانوية المتولدة ، وقد تحققت الدراسات من استقرار الجسيمات النانوية على المدى الطويل في كل من التجارب القائمة على الماء والوسائط الخلوية.

أظهر الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر جسيمات نانوية فلورية محملة بالأجسام المضادة ل EOT ثلاثة وجدت على وجه التحديد على سطح خلايا موسوعة الحياة الواحدة. عند استخدام الأجسام المضادة ل NG two ، فإنها ترتبط على وجه التحديد بسطح المجالات العصبية BSG. تمكنت الجسيمات النانوية الوظيفية الحيوية من تسمية مجموعة من الخلايا المستهدفة بنجاح بالفلورسنت كما تم قياسها بواسطة قياس التدفق الخلوي.

بالإضافة إلى ذلك ، كانت الجسيمات النانوية قادرة على استهداف مجموعة سكانية فرعية معينة من الخلايا في خليط حتى في الخلية المستهدفة المنخفضة للتحكم في نسب الخلايا. أخيرا ، زادت الجسيمات النانوية الوظيفية الحيوية من تباين التصوير بالرنين المغناطيسي للخلايا المستهدفة ، وهي الخلايا المعالجة بجسيمات نانوية محملة ب nng. أظهر جسمان مضادان فرط الكثافة في التسلسلات المرجحة T واحد مقارنة بالخلايا المعالجة بجزيئات التحكم.

في المقابل ، منحت الجسيمان النانويان A NNG كثافة منخفضة في تسلسلين مرجحين T مقارنة بجسيمات التحكم. مرة واحدة الماجستير. يمكن إكمال تخليق الجسيمات النانوية الزرقاء الوظيفية الحيوية في غضون يومين إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

على غرار هذا الإجراء ، يمكن تشغيل الجسيمات النانوية حيويا باستخدام بوليمرات حيوية مختلفة واستهداف الترابط للتحقيق في أمراض جديدة وظروف جديدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الجسيمات النانوية الزرقاء البروسية لتطبيقات التألق والتصوير لتسمية عدد الخلايا. لا تنس اتباع إرشادات السلامة وإجراءات التشغيل القياسية بدقة لإجراء الدراسات في مغناطيس التصوير بالرنين المغناطيسي السريري.