Lepr

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على جزر بنكرياسية حية وقابلة للاستمرار من فئران LEP R DB المصابة بالسكري، وتقييم إفراز الإنسولين من خلايا بيتا داخل الجزر البنكرياسية باستخدام التصوير الفوتوني للخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير الكواشف مثل المزيج الإنزيمي لهضم البنكرياس، وأوساط الزراعة لزراعة الجزر البنكرياسية، والمحلول المنظم خارج الخلوي لاختبار الفوتونين. بعد ذلك، يتم فتح بطن فأر تم القضاء عليه رحيمًا، ويُحقن المزيج الإنزيمي في البنكرياس لهضم العضو.

بعد ذلك، يتم فصل الجُزيرات من الهضم البنكرياسي وزراعتها. وأخيراً، يُستخدم المجهر ثنائي الفوتون لتصوير اندماجات حبيبات الإنسولين المنفردة من خلايا بيتا داخل الجُزيرة. وفي نهاية المطاف، سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على فهم كيفية التحكم في إفراز الإنسولين في حالتي الصحة والمرض.

يتمثل التحسين الرئيسي لتقنية عزل الجزر في استخدام إنزيمات مختلطة لتحسين إنتاجية الجزر وحيويتها. وتعد تقنية التصوير الفوتوني المزدوج حالياً الطريقة الوحيدة لتسجيل إفراز الإنسولين من خلايا متعددة داخل جزيرة سليمة. ولتحضير الإنزيمات لعزل جزر البنكرياس، يتم تخفيف عبوة واحدة تحتوي على 5 mg من liase TL بـ 26 mL من DM EM، ويتم تحضير collagenase type four في محلول Hank's buffer بتركيز 0.5 mg/mL، مضافاً إليه محاليل liase TL وcollagenase المختلطة التالية.

بنسبة أربعة إلى واحد من حيث الحجم، قم بتقسيم خليط الإنزيمات إلى حصص حجمها 2.5 ملليلتر لكل منها واحفظها عند درجة حرارة -20 °C. لتحضير وسط العزل RPMI، قم بإذابة عبوة واحدة من مسحوق RPMI 1 6 4 0 في دورق مخروطي كبير يحتوي على لتر واحد من الماء في درجة حرارة الغرفة، ثم أضف غرامين من بيكربونات الصوديوم و 4.02 غرام من HEPES. استخدم هيدروكسيد الصوديوم لضبط pH إلى 7.4، ثم قم بالتعقيم بالترشيح والحفظ عند درجة حرارة 4 °C.

قم بتحضير وسط استزراع RPMI بإضافة 10% FBS و1% مضادات حيوية إلى وسط عزل RPMI المخصص للتصوير بفوتونين. قم بتحضير محلول منظم خارج خلوي غني بالصوديوم باستخدام الكواشف التالية. ولتحضير الصبغة خارج الخلوية، قم بتحضير مخزون بتركيز ثمانية millimolar من SRB في محلول منظم خارج خلوي، ثم وزع المحلول في أنابيب صغيرة واحفظها عند درجة حرارة 20- درجة مئوية.

للوصول إلى تركيز العمل، استخدم محلولاً منظماً خارجياً (extracellular buffer) طازجاً لتخفيف مخزون صبغة SRB بنسبة 1 إلى 10. بعد التضحية بالفأر ورش جسمه جيداً باستخدام ethanol بتركيز 70% وفقاً للبروتوكول النصي، ضع الحيوان بحيث يكون الرأس باتجاه الجراح والذيل بعيداً عنه. استخدم شقين جانبيين طويلين عبر جلد البطن والبريتون لعمل سديلة على شكل حرف V.

اسحب سديلة الجلد للأعلى للكشف عن كامل التجويف البطني. أزِح الأمعاء جانباً، ومع ثني الأنسجة، ثبّت الكبد في مكانه للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة. بعد ذلك، ضع مشبكاً وعائياً عند الأمبولة على جدار الاثني عشر لمنع الإنزيمات المحقونة من الدخول إلى الاثني عشر.

تعد هذه خطوة مهمة تحدد ما إذا كانت الإنزيمات البنكرياسية ستدخل في ارتجاع القناة البنكرياسية، أو موقع الحقن، أو تدخل إلى الاثني عشر. استخدم إبرة بمقاس 31 gauge لقسطرة القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من نقطة التقاء القناة الكبدية المشتركة والقناة المرارية، مع ترك مساحة لحقنة ثانية. إذا فشل تروية البنكرياس في المرة الأولى، فقم بحقن حوالي 2 mL ببطء من خليط الإنزيمات البارد في القناة الصفراوية المشتركة للفأر.

إذا كانت المشبكة في الموضع الصحيح، فسيتم تروية البنكرياس بسرعة. وبمجرد تروية البنكرياس، أخرج العضو بسرعة وضعه في قارورة زجاجية، ثم حضنه في حمام مائي عند 37 درجة Celsius لمدة 19 دقيقة تقريبًا. بعد التحضين، أوقف عملية الهضم بإضافة 20 milliliters تقريبًا من وسط العزل البارد.

رج القارورة بلطف لتفتيت البنكرياس، ثم صب المحتوى عبر منخل T عادي بقطر مسام 1 mm في أنبوب معقم سعة 50 mL. استخدم وسط العزل لتكملة ملء الأنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند 400 G ودرجة حرارة 4 °C لمدة دقيقة واحدة. مع إيقاف المكبح، أضف وسط العزل إلى الراسب وقم بإذابته.

ثم انقل المعلق إلى أنبوبين سعة 15 milliliter وقم بالطرد المركزي مرة ثانية. بعد سحب الراشح، أضف ستة milliliters من وسط فصل الخلايا بالتدرج الكثافي إلى كل أنبوب، ثم استخدم الماصة أو جهاز الفورتيكس لإعادة التعليق. بعد ذلك، ومن جانب الأنابيب، أضف برفق حوالي ستة milliliters من وسط العزل فوق وسط فصل التدرج الكثافي، ثم قم بالطرد المركزي عند 100 G ودرجة حرارة أربعة °C لمدة 15 minutes.

عند حدوث الانفصال، اجمع الطبقات العليا والوسطى والسفلى في ثلاثة أطباق منفصلة. بعد ذلك، وباستخدام مجهر تشريحي، استعمل ماصة لالتقاط العينات الصغيرة (eyelets) يدوياً من الأطباق الثلاثة. ستوجد أغلب هذه العينات في الطبقة الوسطى، وذلك للمساعدة في تعافي العينات من الهضم الإنزيمي.

قم بتجهيز مجموعات مكونة من 40 من الجزر الليثية في أطباق بتري بقطر 25 سنتيمتر تحتوي على ستة ملليلتر من وسط زراعة RPMI الذي يحتوي على 10 millimolar من الجلوكوز، وتُزرع لمدة يومين. يتم تغيير الوسط يومياً لإجراء التصوير ثنائي الفوتون كاختبار غير مباشر لقياس إفراز الإنسولين. ابدأ باستخدام ثلاثة millimolar من الجلوكوز في محلول منظم خارج خلوي لتحضين الجزر الليثية التي تمت زراعتها لمدة يومين مسبقاً.

قم بوضع الشحم على منصة المجهر لمدة 30 دقيقة لمنع تسرب المحلول، ثم قم بتثبيت غرفة التحكم الحراري التي تحتوي على شريحة زجاجية على منصة المجهر. بعد ذلك، قم بتغطية الغرفة باستخدام 500 µL من محلول منظم خارج الخلية يحتوي على 0.8 mM من SRB وتركيزات مختلفة من الجلوكوز. ثم ضع العيينة (eyelet) التي تم تحضينها مسبقاً في منتصف الغرفة، وقم بضبط التركيز البؤري عند مستوى ثلاث إلى أربع طبقات خلوية داخل العينة.

حيث يظهر التلوين المناعي للأنسولين في جزر لانجرهانز لدى القوارض أن معظم الخلايا هي خلايا بيتا. بعد ذلك، باستخدام المجهر ثنائي الفوتون وعدسة زيتية غاطسة بقوة 60x، يتم تحديد أحداث الإفراز الفردية من خلال الظهور المفاجئ لبقعة فلورية صغيرة. وأخيراً، يتم تأكيد الحدث في برنامج صور المسح الضوئي من خلال مرحلة الصعود السريع للإشارة الفلورية عبر منطقة اهتمام لفأر من النوع البري.

من المتوقع الحصول على حوالي 200 من العيينات (eyelets) باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو. تبدو العينات السليمة ساطعة، وكروية الشكل، ولها حدود ملساء. أما دفعات العزل التي تعرضت لهضم ناقص فعادة ما تحتوي على عينات صغيرة وباهتة وعينات ملتصقة بخلايا أخرى.

بينما تحتوي الدفعة التي خضعت لهضم مفرط على عدد أقل من العيينات (eyelets) في مقايسة الفوتونين استجابةً لمحفزات مثل الجلوكوز أو البوتاسيوم المرتفع، فإن حبيبات الإنسولين المندمجة مع الغشاء البلازمي تسمح بدخول الـ SRB، مما يؤدي إلى ظهور بقعة فلورية مفاجئة يبلغ قطرها حوالي 400 nanometers. وخلال الوقت المسجل، يتم تحديد جميع أحداث الإفراز الخارجي استجابةً للمحفز، بالإضافة إلى موقع هذه الأحداث، ووقت ظهورها، ومدتها، ونوع الاندماج. يتم توصيف أحداث مثل "KISS and Run" أو الاندماج الكامل، وهي ذات قيمة لتقييم أي خلل في اندماج الحبيبات في نماذج مرض السكري من النوع الثاني.

استُخدمت هذه الطريقة لإظهار أن الخلل في جزر لانجرهانس لدى فئران DB DB المصابة بالسكري يكمن في فقدان الاندماج الكامل للحبيبات، وليس في تغير حركية اندماج الحبيبات الفردية. علاوة على ذلك، فإن العامل الأكبر الذي يؤثر على انخفاض إفراز الإنسولين في المرض هو النقص في عدد الخلايا المستجيبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لعملية تروية البنكرياس وتنشيط الجزر من فئران RDB، وأن تكون قادراً أيضاً على إجراء مقايسات لسانين لتقييم استجابات الإفراز داخل الجزر السليمة.