Name: Lepr ديسيبل نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: تعلم عزل جزر لانغرهانس من فئران Lepr db المصابة بالسكري من النوع الثاني وتقييم إفراز الأنسولين باستخدام مجهر الفوتون المزدوج. يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لفهم آليات إفراز الأنسولين في الأمراض.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل منحة مجلس البحوث الأسترالي DP110100642 (إلى PT) ومنح المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية APP1002520 و APP1059426 (إلى PT و HYG).

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب الحالية وفقا للإجراءات الأخلاق الحيوانية المحلية من جامعة كوينزلاند (التي وافقت عليها جامعة كوينزلاند، تشريحي جنة الأخلاقيات العلوم البيولوجية). 1. جزيرة العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من الإنزيمات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهضم البنكرياس، واستخدام خليط من liberase وكولاجيناز النوع الرابع. تمييع TL liberase (منخفض thermolysin) 1 قنينة من 5 ملغ مع 26 مل من DMEM (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كولاجيناز النوع الرابع في المخزن هانك بتركيز 0.5mg / مل، على أن تستكمل مع 5MM HEPES، 0.5MM CaCl 2، 0.1mg / مل الدناز و1mg / مل ألبومين المصل البقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط TL liberase والحلول كولاجيناز في نسبة 4: 1 (من حيث الحجم)، أي 4 مل liberase TL + 1 مل كولاجيناز. قسامة مزيج من الأنزيمات ل2.5ML كل وتخزينها في -20 ° C. ملاحظة: حضانة مرات الأنسجة الخامسآرى قليلا بين دفعات من انزيم (30 ثانية إلى 1 دقيقة الفرق). لذلك، قد تكون هناك حاجة إلى اختبار دفعة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI عزل وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل قنينة واحدة من RPMI 1640 المسحوق في 1 لتر من الماء في RT وتكملة مع 2 غرام NaHCO 3، 4.02 غرام HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين وسائل الإعلام العزلة RPMI في قارورة مخروطية كبيرة، مع مزيج النمام المغناطيسي، والتكيف مع درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI الثقافة وسائل الإعلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام RPMI سائل الإعلام والثقافة، مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ المضادات الحيوية (مثل البنسلين 100 U / مل، الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل جزيرة والتثقيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الحيوانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم أو CO 2 الخنق وفقا للإجراءات أخلاقيات المؤسسة المحلية. رش جسم الفأر تماما مع الايثانول 70٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإرواء البنكرياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> USE 2 التخفيضات طويلة أفقيا من خلال الجلد في منطقة البطن والصفاق لجعل رفرف على شكل حرف V. سحب رفرف من الجلد حتى كشف تجويف البطن بأكمله، وضعت جانبا الأمعاء والحفاظ على الكبد في مكان من المناديل الورقية المطوية للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة (الشكلان 1 و 2). وضع الحيوان بحيث اتجه نحو الجراح والذيل بعيدا عن الجراح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق المشبك الأوعية الدموية في أمبولة على الحائط الاثني عشر لمنع الانزيمات حقن من دخول العفج (الشكل 1). ملاحظة: هذه خطوة مهمة لأنها تحدد ما إذا كانت الإنزيمات حقن سيذهب إلى القناة البنكرياسية ويروي البنكرياس أو الجزر إلى موقع الحقن (أكثر من الشبك) أو الخوض في الاثني عشر (تحت المشبك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة مع G إبرة 31 بالقرب من تقاطع القناة الكبدية المشتركة والقناة المرارية (الشكل 1)، وتترك مجالا لحقن الثاني إذا عشرفشل البريد البنكرياس ليروي للمرة الأولى. ببطء (أكثر من ~ 10 ثانية) ضخ حوالي 2 مل من خليط انزيم البارد في الماوس القناة الصفراوية المشتركة. ملاحظة: سيتم perfused لالبنكرياس بسرعة إذا المشبك هو في المكان المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف المشبك إذا كانت إبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة ولكن لا يمكن أن يروي البنكرياس (أي، نقل ما يصل المشبك قليلا بعيدا عن الكبد إذا كان أكثر من فرضت أو تحريكه لأسفل قليلا إلى الكبد إذا فرضت تحت). ملاحظة: إبرة يذهب في بعض الأحيان إلى الكبسولة المحيطة بدلا من تجويف القناة. وهناك علامة مفيدة للتحقق ما إذا كانت الإبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة هو تمدد القناة عند حقن. إذا فشل البنكرياس ليروي، والبديل هو يمكن حقن خليط انزيم إلى مواقع متعددة من البنكرياس مع انخفاض العائد المتوقع. نضح الموقع الأيسر من البنكرياس (الفص الطحال) مهم لتعظيم العائد جزيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد البنكرياس صerfused، بسرعة إزالة البنكرياس، ووضعها في قارورة (~ 20 مل، والزجاج)، واحتضان ل~ 19 دقيقة في 37 ° C حمام الماء. ملاحظة: فترة حضانة يمكن أن تختلف قليلا اعتمادا على سلالة الماوس والعمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة، إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة ~ 20 مل من وسائل الإعلام العزلة الباردة. هزة القارورة بلطف لتعطيل البنكرياس وتصب عليه من خلال غربال الشاي العادي (قطر المسام من 1 ملم) في أنبوب معقم 50 مل. ملأ الأنبوب مع وسائل الإعلام العزل والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بيليه في وسائل الإعلام العزلة مرة أخرى، ونقل إلى اثنين من 15 مل أنابيب، ثم الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. بعد تطلع طاف، مزج الكريات اثنين بشكل جيد مع 6 مل من وسائل الإعلام كثافة الفصل المتدرج الخلية (Histopaque 1077 الحل) في أنبوب من قبل vortexing أو pipetting صعودا وهبوطا. ثم إضافة بلطف ~ 6 مل من وسائل الإعلام العزلة إلى جانب أنبوب على رأسوسائل الاعلام فصل التدرج الكثافة وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف في الأعلى (وسائل الإعلام العزلة)، الوسطى والدنيا (كثافة الخلية التدرج وسائل الاعلام فصل) طبقة في 3 أطباق منفصلة. انتقاء الجزر في هذه الأطباق 3، وذلك باستخدام ماصة تحت المجهر تشريح. ملاحظة: الطبقة الوسطى يحتوي على معظم الجزر. يتم الاعتراف الجزر عن الهياكل المدمجة من ~ 50-500 ميكرون في الحجم (الشكل 3). نحصل ~ 200 الجزر في الفئران WT و300- 100 &lt;الجزر في الفئران ديسيبل / ديسيبل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جزيرة التثقيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمساعدة الجزر على التعافي من انزيم الهضم والجماعات ثقافة 40 الجزر في 25 سم طبق بتري مع 6ML RPMI سائل الإعلام والثقافة (10MM الجلوكوز) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ / 95٪ CO 2 / O 2 ل2 قبل أيام من العيش -cell 2 الفوتون التصوير. تغيير ثقافة وسائل الإعلام يوميا. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. يعيش الخلية 2 فوتون التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خارج الخلية العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الصوديوم خارج الخلية غنية عازلة للمقايسة 2 الفوتون مع 140 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2.5 ملي CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 5 ملي NaHCO 3 و 10 ملي HEPES. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خارج الخلية صبغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمقايسة 2 الفوتون، وإعداد الأوراق المالية SRB 8 ملم في المخزن خارج الخلية، قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في -20 ° C. تمييع SRB الأسهم 01:10 العازلة في الخلية الطازجة للحصول على تركيز العمل من 0.8 ملم. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير الفوتون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا، قبل احتضان الجزر مثقف 2 يوما في 3 ملي العازلة خارج الخلية الجلوكوز لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: نحن نستخدم الجزر بين 2 و 5 أيام في الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، ضع شريحة زجاجية على غرفة التحكم الحرارية التي شنت على المسرح المجهر. استخدام الشحوم لمنع تسريب حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية غرفة مع 500 ميكرولتر من extracellجزيئية العازلة التي تحتوي على 0.8 ملي SRB مع تركيزات الجلوكوز مختلفة (3 ملم، 6 ملم، 15 ملم و 20 ملم الجلوكوز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، وضع جزيرة قبل المحتضنة في منتصف الغرفة والتركيز على 3-4 طبقات الخلايا في جزيرة حيث، في الجزر القوارض، المناعية للأنسولين يدل على أن معظم الخلايا هي خلايا بيتا. ملاحظة: سيتم SRB الخطوط العريضة عن غشاء الخلية للجزيرة بسرعة وجزيرة جاهز للصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر 2 الفوتون مع الهدف 60X الغمر النفط (NA 1.42) وبرامج التصوير (على سبيل المثال، ScanImage 11). الشكل 4 يوضح ترتيب المجهر نموذجي. صورة أحداث exocytic باستخدام SRB كما غشاء impermeant علامة خارج الخلية الفلورسنت متحمس بواسطة نبضات ليزر الفيمتو ثانية في 880 نانومتر، مع مضان الكشف على 550-650 نانومتر. تسجيل استجابات جزيرة لتحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأحداث exocytic واحدة من قبل الظهور المفاجئ لبقعة صغيرة الفلورسنت (القرار 10 بكسل /1؛ م) وتأكيد من قبل مرحلة ارتفاع سريع للإشارة الفلورسنت على المنطقة ذات الاهتمام (~ 0.78 ميكرون 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

<html> العامل الأكثر أهمية في عزلة جزيرة هو نضح الأولي من البنكرياس. وتحت perfused لنتائج البنكرياس في أقل من ذلك بكثير العائد جزيرة. عوامل أخرى تؤثر أيضا على جودة العزل مثل الوقت الهضم ومستوى الهز الذي يمكن أن يعوض جزئيا عن مستوى التروية. على سبيل المثال، سوف تحتاج إلى البنكرياس perfused لبالكامل لتكون المحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 18 دقيقة ~ 30 ثانية في حين يهز بلطف، في المقابل وكيل هضمها قد تتطلب البنكرياس ~ 20 دقيقة الهضم مع اهتزاز أصعب. مزيج من اثنين من الانزيمات والهضم في أي...

دور ضعف خلايا بيتا في المرض وقد تم الاعتراف على نطاق واسع 3،4. خطوط الخلايا مثل MIN6 وINS-1 هي أدوات مفيدة لفهم بيولوجيا السلوك خلايا بيتا. ومع ذلك، التحكم الفسيولوجية لإفراز الأنسولين تجري داخل جزر لانجرهانز. هذه الجزر تحتوي على الآلاف من خلايا بيتا معبأة بإحكام، وكذلك الأوعية الدموية وغيرها من أنواع الخلايا في الغدد الصماء. هذه البيئة داخل جزيرة يؤثر إفراز الأنسولين، ومن المرجح أن تكون مهمة في مرض السكري. لذلك، لفهم السيطرة الفسيولوجية لإفراز الأنسولين، والفيزيولوجيا المرضية للمرض، فمن الضروري لدراسة الجزر سليمة. جزيرة العزلة الجزر الإنسان الحي و، ولا سيما الجزر الإنسان من مرضى داء السكري من النوع 2 ويصعب الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك، الجزر البشرية لديها إمكانيات محدودة للتلاعب الجزيئية التجريبية. لذا استخدم الباحثون هويتيح من الحيوانات والنماذج الحيوانية من مرض السكري من النوع 2. نموذج واحد من هذا القبيل هو مرض الماوس ديسيبل / ديسيبل. هذا هو طفرة تلقائية أن النماذج داء السكري من النوع 2 مع تطور النمط الظاهري الذي يوازي بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر 5،6. بروتوكول المعروضة هنا للجزيرة بمعزل عن السكري الفئران ديسيبل / ديسيبل لديه العديد من الخطوات المشتركة مع المجموعات الأخرى مع بعض التحسينات لأفضل عائد وتنقية وتعزيز بقاء الجزيرة. التصوير 2 الفوتون الخلية الحية فحص 2 الفوتون هو موضح هنا تمكن الباحثين من تحديد عدد وتقييم خصائص الحبيبات التي تحتوي على الانسولين واحدة من العديد من الخلايا من السكري 7 والنوع البري الجزر 8،9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 مجم</td><td></td> <td>Roche-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>كولاجيناز نوع IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 مل</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 متوسط (10x) 1 لتر</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>لتحضير وسائط العزل</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 مل</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>لإعداد الوسائط المستنبتة</td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين 100 مل</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>لإعداد الوسائط المستنبتة &nbsp ؛</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني 500 مل</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>لإعداد الوسائط المستنبتة</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td> <td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>لتخفيف</td></tr><tr><td>برنامج liberase Metamorph</td><td>الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td></td><td>لتحليل الصور المكونة من 2 فوتون</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

داء السكري من النوع 2 هو مرض مزمن يؤثر على 382 مليون شخص في عام 2013، ومن المتوقع أن يرتفع إلى 592،000،000 بحلول عام 2035 1. وخلال العقود الماضية 2، ودور ضعف خلايا بيتا في داء السكري من النوع 2 تم تأسيس بوضوح 2. وقد تطلب تقدم البحوث طرق لعزل الجزر البنكرياسية. بروتوكول للعزلة جزيرة قدم هنا أسهم العديد من الخطوات المشتركة مع البروتوكولات من المجموعات الأخرى، مع بعض التعديلات لتحسين المحصول وجودة من الجزر المعزولة من كل من النوع البري والسكري ديسيبل Lepr (ديسيبل / ديسيبل) الفئران. ثم ويرد الخلية الحية 2-الفوتون طريقة التصوير التي يمكن استخدامها لتحقيق السيطرة على إفراز الأنسولين داخل الجزر.

العائد جزيرة وتنقية لالعادي النوع البري الماوس، ومن المتوقع حوالي 200 الجزر. الجزر صحية تبدو مشرقة، على شكل دائري ولها حدود على نحو سلس. دفعة العزلة على هضم عادة الجزر الصغيرة وغامض في حين أن دفعة هضمها تحت ديها عدد أقل من الجزر والجزر خلية المرفقة عنيبية (الشكل 3). لمرضى السكري الفئران ديسيبل / ديسيبل، العائد جزيرة والمظهر يعتمد على تطور المرض مع الفئران نسبة السكر في الدم أفضل لها أكبر، الجزر أ...

نقدم هنا بروتوكولا لعزل الجزر الصغيرة عن نموذج الفأر لمرض السكري من النوع 2 ، Leprdb وتفاصيل اختبار الخلايا الحية لقياس إفراز الأنسولين من الجزر السليمة التي تستخدم 2 مجهر فوتون.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على جزر بنكرياسية حية وقابلة للاستمرار من فئران LEP R DB المصابة بالسكري، وتقييم إفراز الإنسولين من خلايا بيتا داخل الجزر البنكرياسية باستخدام التصوير الفوتوني للخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير الكواشف مثل المزيج الإنزيمي لهضم البنكرياس، وأوساط الزراعة لزراعة الجزر البنكرياسية، والمحلول المنظم خارج الخلوي لاختبار الفوتونين. بعد ذلك، يتم فتح بطن فأر تم القضاء عليه رحيمًا، ويُحقن المزيج الإنزيمي في البنكرياس لهضم العضو.بعد ذلك، يتم فصل الجُزيرات من الهضم البنكرياسي وزراعتها. وأخيراً، يُستخدم المجهر ثنائي الفوتون لتصوير اندماجات حبيبات الإنسولين المنفردة من خلايا بيتا داخل الجُزيرة. وفي نهاية المطاف، سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على فهم كيفية التحكم في إفراز الإنسولين في حالتي الصحة والمرض.يتمثل التحسين الرئيسي لتقنية عزل الجزر في استخدام إنزيمات مختلطة لتحسين إنتاجية الجزر وحيويتها. وتعد تقنية التصوير الفوتوني المزدوج حالياً الطريقة الوحيدة لتسجيل إفراز الإنسولين من خلايا متعددة داخل جزيرة سليمة. ولتحضير الإنزيمات لعزل جزر البنكرياس، يتم تخفيف عبوة واحدة تحتوي على 5 mg من liase TL بـ 26 mL من DM EM، ويتم تحضير collagenase type four في محلول Hank's buffer بتركيز 0.5 mg/mL، مضافاً إليه محاليل liase TL وcollagenase المختلطة التالية.بنسبة أربعة إلى واحد من حيث الحجم، قم بتقسيم خليط الإنزيمات إلى حصص حجمها 2.5 ملليلتر لكل منها واحفظها عند درجة حرارة -20 °C. لتحضير وسط العزل RPMI، قم بإذابة عبوة واحدة من مسحوق RPMI 1 6 4 0 في دورق مخروطي كبير يحتوي على لتر واحد من الماء في درجة حرارة الغرفة، ثم أضف غرامين من بيكربونات الصوديوم و 4.02 غرام من HEPES. استخدم هيدروكسيد الصوديوم لضبط pH إلى 7.4، ثم قم بالتعقيم بالترشيح والحفظ عند درجة حرارة 4 °C.قم بتحضير وسط استزراع RPMI بإضافة 10% FBS و1% مضادات حيوية إلى وسط عزل RPMI المخصص للتصوير بفوتونين. قم بتحضير محلول منظم خارج خلوي غني بالصوديوم باستخدام الكواشف التالية. ولتحضير الصبغة خارج الخلوية، قم بتحضير مخزون بتركيز ثمانية millimolar من SRB في محلول منظم خارج خلوي، ثم وزع المحلول في أنابيب صغيرة واحفظها عند درجة حرارة 20- درجة مئوية.للوصول إلى تركيز العمل، استخدم محلولاً منظماً خارجياً (extracellular buffer) طازجاً لتخفيف مخزون صبغة SRB بنسبة 1 إلى 10. بعد التضحية بالفأر ورش جسمه جيداً باستخدام ethanol بتركيز 70% وفقاً للبروتوكول النصي، ضع الحيوان بحيث يكون الرأس باتجاه الجراح والذيل بعيداً عنه. استخدم شقين جانبيين طويلين عبر جلد البطن والبريتون لعمل سديلة على شكل حرف V.اسحب سديلة الجلد للأعلى للكشف عن كامل التجويف البطني. أزِح الأمعاء جانباً، ومع ثني الأنسجة، ثبّت الكبد في مكانه للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة. بعد ذلك، ضع مشبكاً وعائياً عند الأمبولة على جدار الاثني عشر لمنع الإنزيمات المحقونة من الدخول إلى الاثني عشر.تعد هذه خطوة مهمة تحدد ما إذا كانت الإنزيمات البنكرياسية ستدخل في ارتجاع القناة البنكرياسية، أو موقع الحقن، أو تدخل إلى الاثني عشر. استخدم إبرة بمقاس 31 gauge لقسطرة القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من نقطة التقاء القناة الكبدية المشتركة والقناة المرارية، مع ترك مساحة لحقنة ثانية. إذا فشل تروية البنكرياس في المرة الأولى، فقم بحقن حوالي 2 mL ببطء من خليط الإنزيمات البارد في القناة الصفراوية المشتركة للفأر.إذا كانت المشبكة في الموضع الصحيح، فسيتم تروية البنكرياس بسرعة. وبمجرد تروية البنكرياس، أخرج العضو بسرعة وضعه في قارورة زجاجية، ثم حضنه في حمام مائي عند 37 درجة Celsius لمدة 19 دقيقة تقريبًا. بعد التحضين، أوقف عملية الهضم بإضافة 20 milliliters تقريبًا من وسط العزل البارد.رج القارورة بلطف لتفتيت البنكرياس، ثم صب المحتوى عبر منخل T عادي بقطر مسام 1 mm في أنبوب معقم سعة 50 mL. استخدم وسط العزل لتكملة ملء الأنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند 400 G ودرجة حرارة 4 °C لمدة دقيقة واحدة. مع إيقاف المكبح، أضف وسط العزل إلى الراسب وقم بإذابته.ثم انقل المعلق إلى أنبوبين سعة 15 milliliter وقم بالطرد المركزي مرة ثانية. بعد سحب الراشح، أضف ستة milliliters من وسط فصل الخلايا بالتدرج الكثافي إلى كل أنبوب، ثم استخدم الماصة أو جهاز الفورتيكس لإعادة التعليق. بعد ذلك، ومن جانب الأنابيب، أضف برفق حوالي ستة milliliters من وسط العزل فوق وسط فصل التدرج الكثافي، ثم قم بالطرد المركزي عند 100 G ودرجة حرارة أربعة °C لمدة 15 minutes.عند حدوث الانفصال، اجمع الطبقات العليا والوسطى والسفلى في ثلاثة أطباق منفصلة. بعد ذلك، وباستخدام مجهر تشريحي، استعمل ماصة لالتقاط العينات الصغيرة (eyelets) يدوياً من الأطباق الثلاثة. ستوجد أغلب هذه العينات في الطبقة الوسطى، وذلك للمساعدة في تعافي العينات من الهضم الإنزيمي.قم بتجهيز مجموعات مكونة من 40 من الجزر الليثية في أطباق بتري بقطر 25 سنتيمتر تحتوي على ستة ملليلتر من وسط زراعة RPMI الذي يحتوي على 10 millimolar من الجلوكوز، وتُزرع لمدة يومين. يتم تغيير الوسط يومياً لإجراء التصوير ثنائي الفوتون كاختبار غير مباشر لقياس إفراز الإنسولين. ابدأ باستخدام ثلاثة millimolar من الجلوكوز في محلول منظم خارج خلوي لتحضين الجزر الليثية التي تمت زراعتها لمدة يومين مسبقاً.قم بوضع الشحم على منصة المجهر لمدة 30 دقيقة لمنع تسرب المحلول، ثم قم بتثبيت غرفة التحكم الحراري التي تحتوي على شريحة زجاجية على منصة المجهر. بعد ذلك، قم بتغطية الغرفة باستخدام 500 µL من محلول منظم خارج الخلية يحتوي على 0.8 mM من SRB وتركيزات مختلفة من الجلوكوز. ثم ضع العيينة (eyelet) التي تم تحضينها مسبقاً في منتصف الغرفة، وقم بضبط التركيز البؤري عند مستوى ثلاث إلى أربع طبقات خلوية داخل العينة.حيث يظهر التلوين المناعي للأنسولين في جزر لانجرهانز لدى القوارض أن معظم الخلايا هي خلايا بيتا. بعد ذلك، باستخدام المجهر ثنائي الفوتون وعدسة زيتية غاطسة بقوة 60x، يتم تحديد أحداث الإفراز الفردية من خلال الظهور المفاجئ لبقعة فلورية صغيرة. وأخيراً، يتم تأكيد الحدث في برنامج صور المسح الضوئي من خلال مرحلة الصعود السريع للإشارة الفلورية عبر منطقة اهتمام لفأر من النوع البري.من المتوقع الحصول على حوالي 200 من العيينات (eyelets) باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو. تبدو العينات السليمة ساطعة، وكروية الشكل، ولها حدود ملساء. أما دفعات العزل التي تعرضت لهضم ناقص فعادة ما تحتوي على عينات صغيرة وباهتة وعينات ملتصقة بخلايا أخرى.بينما تحتوي الدفعة التي خضعت لهضم مفرط على عدد أقل من العيينات (eyelets) في مقايسة الفوتونين استجابةً لمحفزات مثل الجلوكوز أو البوتاسيوم المرتفع، فإن حبيبات الإنسولين المندمجة مع الغشاء البلازمي تسمح بدخول الـ SRB، مما يؤدي إلى ظهور بقعة فلورية مفاجئة يبلغ قطرها حوالي 400 nanometers. وخلال الوقت المسجل، يتم تحديد جميع أحداث الإفراز الخارجي استجابةً للمحفز، بالإضافة إلى موقع هذه الأحداث، ووقت ظهورها، ومدتها، ونوع الاندماج. يتم توصيف أحداث مثل "KISS and Run" أو الاندماج الكامل، وهي ذات قيمة لتقييم أي خلل في اندماج الحبيبات في نماذج مرض السكري من النوع الثاني.استُخدمت هذه الطريقة لإظهار أن الخلل في جزر لانجرهانس لدى فئران DB DB المصابة بالسكري يكمن في فقدان الاندماج الكامل للحبيبات، وليس في تغير حركية اندماج الحبيبات الفردية. علاوة على ذلك، فإن العامل الأكبر الذي يؤثر على انخفاض إفراز الإنسولين في المرض هو النقص في عدد الخلايا المستجيبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لعملية تروية البنكرياس وتنشيط الجزر من فئران RDB، وأن تكون قادراً أيضاً على إجراء مقايسات لسانين لتقييم استجابات الإفراز داخل الجزر السليمة.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

في هذا الفيديو ، نصف التصوير داخل الحيوية لبنكرياس الفأر من خلال نافذة مستقرة للتصور طويل المدى للديناميكيات الخلوية.

التصوير داخل الحيوية: طريقة لمراقبة المستوى الخلوي لبنكرياس الفأر من خلال نافذة تصوير مستقرة

يوضح هذا الفيديو طريقة قائمة على التصوير لتصور خلايا بيتا المزروعة التي تعبر عن اللوسيفيراز في فأر يعاني من نقص المناعة السكري غير المفرط. يؤدي إدخال خلايا الطحال من الفأر المصاب بالسكري إلى تدمير خلايا بيتا التدريجي ، والذي تم تأكيده بصريا من خلال انخفاض اللمعان بعد إدخال الركيزة.

تصوير خلايا بيتا المعدلة وراثيا في فأر يعاني من نقص المناعة ويواجه تحديا لخلايا الطحال السكرية

نهج جديد يجمع بين العين وزرع المجهري متحد البؤر تمكن طولية، غير الغازية في الوقت الحقيقي التصوير مع وحيدة الخلية القرار داخل أنسجة...

زرع في الغرفة الأمامية للعين لالطولية، غير الغازية<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير مع وحيدة الخلية القرار في الوقت الحقيقي

يمكننا وصف بروتوكول للتصور للرقابة الأنسولين في الجزيرات سليمة باستخدام فلورين، بروتين فلوري أخضر حساسة لدرجة الحموضة. الجزر الصغيرة المعزولة مصابون بترميز فلورين بالإضافة إلى البضائع حويصلة neuropeptide Y إتش. وهذا يسمح للكشف عن أحداث الانصهار الحبيبية الأنسولين بالفحص المجهري [كنفوكل].

[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية

وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

السابقين فيفو الدراسات جزيرة البنكرياس تعتبر هامة لأبحاث مرض السكري. التقنيات القائمة لدراسة الجزيرات المزروعة في بهم العمارة 3 الأبعاد الأصلية مضيعة للوقت وغير كفؤة، والمستخدمة بشكل متكرر. ويصف هذا العمل طريقة جديدة وبسيطة وفعالة لتوليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات مثقف كلياً.

جزيرة البنكرياس التضمين لمقاطع البارافين

هنا ، نقدم بروتوكولا للتصوير وقياس ديناميات الكالسيوم في الخلايا غير المتجانسة السكان ، مثل خلايا جزيرة البنكرياس. يتم تسليم الصحفيين الفلورسنت إلى الطبقة الطرفية من الخلايا داخل الجزيرة ، والتي يتم بعد ذلك التعبئة والتصوير ، ويتم اجراء تحليل لكل خليه من ديناميات كثافة الفلورية.

تصوير ديناميات الكالسيوم في السكان الفرعيين من خلايا الفئران جزيرة البنكرياس

والهدف من هذا البروتوكول هو رصد مستمر لديناميات عملية صيد الجزر البنكرياسية البشرية والبلدان المضيفة المساهمة مقابل الخلايا المانحة. ويتم ذلك عن طريق زرع الجزر البشرية في الغرفة الأمامية للعين (ACE) من NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-المتلقي الماوس تليها تكرار 2-فوتون التصوير.

الطولية في التصوير فيفو و الكم من تطعيم جزيرة البنكرياس الإنسان والخلايا المضيفة المساهمة في غرفة العين الأمامية

تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرية.

مراقبة وظيفة الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرة في شرائح أنسجة البنكرياس الحية

في الجسم الحي عالية الدقة التصوير البنكرياس تم تسهيل مع نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس.

استقر الطولي في فيفو الخلوية المستوى التصور من البنكرياس في نموذج مورين مع نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس

نوفر بروتوكولا طفيف التوغل لزراعة العضلات لجزر الخلايا الجذعية المشتقة من خلايا البنكرياس البشرية إلى فئران تعاني من نقص المناعة لزرع الزراعة في الجسم الحي ، والتحليل اللاحق.

زراعة الخلايا الغدية الصماء المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية عبر العضلات في الفئران

تعلم عزل جزر لانغرهانس من فئران Lepr db المصابة بالسكري من النوع الثاني وتقييم إفراز الأنسولين باستخدام مجهر الفوتون المزدوج. يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لفهم آليات إفراز الأنسولين في الأمراض.

Lepr

استكشف المزيد من الفيديوهات