Lepr ديسيبل نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة
مايو 11, 2015
نقدم هنا بروتوكولا لعزل الجزر الصغيرة عن نموذج الفأر لمرض السكري من النوع 2 ، Leprdb وتفاصيل اختبار الخلايا الحية لقياس إفراز الأنسولين من الجزر السليمة التي تستخدم 2 مجهر فوتون.
الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على ثقوب حية قابلة للحياة من الفئران المصابة بالسكري LEP R DB ، وتقييم إفراز الأنسولين من خلايا بيتا داخل الثقوب باستخدام الخلايا الحية لتصوير الفوتون. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الكواشف أولا مثل خليط الإنزيم لهضم البنكرياس ، ووسط الثقافة لزراعة العيينة ، والمخزن المؤقت خارج الخلية لمقايسة الفوتونين. بعد ذلك ، يتم فتح بطن الفأر القتل الرحيم ويتم حقن خليط الإنزيم في البنكرياس لهضم العضو.
ثم يتم فصل الثقوب عن هضم البنكرياس وزراعتها. أخيرا ، يتم استخدام اثنين من المجهريات الفوتينية لتصوير اندماج حبيبات الأنسولين المفردة من خلايا بيتا داخل العيبة. في النهاية ، سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على فهم كيفية التحكم في إفراز الأنسولين في الصحة والمرض.
التحسين الرئيسي لتقنية عزل العيينة هو استخدام الإنزيمات المختلطة لتحسين العائد وصلاحية الثقوب. تقنية تصوير الفوتونين هي الطريقة الوحيدة حاليا لتسجيل إفراز الأنسولين من خلايا متعددة داخل ثقب سليم. لتحضير إنزيمات لعزل ثقوب البنكرياس ، قم بتخفيف قارورة واحدة من خمسة ملليغرام من liase TL مع 26 مل من DM EM ، قم بإعداد الكولاجيناز من النوع الرابع في مخزن هانك إلى تركيز 0.5 ملليغرام لكل مليلتر ، مع استكمال محاليل liase TL والكولاجيناز المختلطة التالية.
بنسبة أربعة إلى واحد من حيث الحجم ، قم بنقل خليط الإنزيمات إلى 2.5 مل لكل منها وتخزينه عند سالب 20 درجة مئوية. لتحضير وسط عزل RPMI في قارورة مخروطية كبيرة تحتوي على لتر واحد من الماء ، قم بإذابة قارورة واحدة من مسحوق RPMI 1 6 4 0 في درجة حرارة الغرفة واستكمالها بجرامين من بيكربونات الصوديوم و 4.02 جرام من الهيبيين. استخدم هيدروكسيد الصوديوم لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، ثم قم بتصفيته وتعقيمه وتخزينه عند أربع درجات مئوية.
اصنع وسيطا لثقافة RPMI عن طريق إضافة 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية إلى وسط عزل RPMI لتصوير الفوتونين. قم بإعداد مخزن مؤقت غني بالصوديوم خارج الخلية باستخدام الكواشف التالية. لتحضير صبغة خارج الخلية ، اصنع ثمانية مللي مولار من SRB عبارة عن مخزن مؤقت خارج الخلية في أنابيب صغيرة وخزنها عند سالب 20 درجة مئوية.
للوصول إلى تركيز العمل ، استخدم عازلة جديدة خارج الخلية لتخفيف المخزون SRB من واحد إلى 10. بعد التضحية بالفأر واستخدام 70٪ من الإيثانول لرش جسم الفأر جيدا وفقا لبروتوكول النص ، ضع مع الرأس باتجاه الذيل بعيدا عن الجراح. استخدم قطعتين جانبيتين طويلتين عبر جلد البطن والصفاق لعمل سديلة على شكل حرف V.
اسحب سديلة الجلد لأعلى لتكشف تجويف البطن بالكامل. ضع الأمعاء جانبا ومع الأنسجة المطوية ، حافظ على الكبد في مكانه للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة. بعد ذلك ، ضع مشبك وعائي في سيارة الإسبتا على جدار الاثني عشر لمنع الإنزيمات المحقونة من دخول الاثني عشر.
هذه خطوة مهمة تحدد ما إذا كانت إنزيمات البنكرياس تدخل ارتجاع قناة البنكرياس أو موقع الحقن أو تدخل الاثني عشر. استخدم إبرة قياس 31 لتقلية القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من تقاطع القناة الكبدية المشتركة والقناة الكيسية واترك مجالا للحقن الثاني. إذا فشل البنكرياس في الاختراق في المرة الأولى ، فقم بحقن حوالي ملليلترين من خليط الإنزيم البارد ببطء في القناة الصفراوية المشتركة للفأر.
إذا كان المشبك في الموضع الصحيح ، ترشيح البنكرياس بسرعة. بمجرد أن يتم نفخ البنكرياس ، قم بإزالة العضو بسرعة ، وضعه في قارورة زجاجية واحتضانه في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 19 دقيقة تقريبا. بعد الحضانة ، أوقف عملية الهضم بإضافة ما يقرب من 20 مل من وسط العزل البارد.
رج القارورة برفق لتعطيل البنكرياس واسكبها من خلال T sive عادي بحجم مسام واحد ملليمتر واحد في أنبوب معقم 50 ملليلتر. استخدم وسيط العزل لرفع الأنبوب وجهاز الطرد المركزي عند 400 جم وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. مع الانفصال ، أضف وسط العزل إلى الحنك وقم بإذابته.
ثم انقل التعليق إلى أنبوبين سعة 15 مليلتر وقم بالدوران مرة ثانية. بعد شفط السوبينات ، أضف ستة ملليلتر من وسط فصل الخلايا المتدرجة الكثافة إلى كل لوحة وماصة أو دوامة إلى التقشير. ثم إلى جانب الأنابيب ، أضف برفق ما يقرب من ستة ملليلتر من وسط العزل فوق جهاز الطرد المركزي المتوسط لفصل تدرج الكثافة عند 100 جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
مع الانفصال ، اجمع الطبقات العلوية والوسطى والسفلية في ثلاثة أطباق منفصلة. ثم تحت المجهر التشريحي ، استخدم ماصة لاختيار الثقوب يدويا في الأطباق الثلاثة. سيتم العثور على الغالبية في الطبقة الوسطى لمساعدة الثقوب على التعافي من هضم الإنزيم.
تحضير مجموعات من 40 ثقوب في أطباق بتري 25 سم مع ستة ملليلتر من وسط زراعة RPMI يحتوي على 10 ملليمولار جلوكوز ومزرعة لمدة يومين. تغيير الوسيط يوميا لإجراء تصوير فوتونين كمقايسة غير مباشرة لقياس إفراز الأنسولين. ابدأ باستخدام ثلاثة مللي مولار من الجلوكوز في المخزن المؤقت خارج الخلية لاحتضان الثقوب المستنبتة لمدة يومين مسبقا.
لمدة 30 دقيقة ، ضع الشحوم على مرحلة المجهر لمنع تسرب المحلول وقم بتركيب غرفة التحكم الحراري التي تحتوي على شريحة زجاجية على مرحلة المجهر. ثم مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت خارج الخلية الذي يحتوي على 0.8 مللي مولار ، يغطي SRB وتركيزات الجلوكوز المختلفة الغرفة. بعد ذلك ، ضع الثقب المحتضن مسبقا في منتصف الغرفة وركز على ثلاث إلى أربع طبقات خلوية في العينة.
حيث يظهر التلوين المناعي للأنسولين في ثقوب القوارض أن معظم الخلايا هي خلايا بيتا. ثم باستخدام مجهر الفوتون وهدف غمر الزيت 60 × ، حدد الأحداث الحمضية الخارجية الفردية من خلال الظهور المفاجئ لبقعة فلورية صغيرة. أخيرا ، في برنامج صورة المسح الضوئي ، تأكد من حدث من خلال مرحلة الارتفاع السريع لإشارة الفلورسنت فوق منطقة اهتمام فأر من النوع البري.
من المتوقع أن يكون هناك حوالي 200 ثقب باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو. تبدو الثقوب الصحية مشرقة ومستديرة الشكل ولها حدود ناعمة. وعادة ما تحتوي دفعة العزل المهضومة على ثقوب صغيرة وغامضة وثقوب متصلة بخلايا أسار.
في حين أن الدفعة التي تم هضمها بشكل مفرط تحتوي على عدد أقل من الثقوب في مقايسة الفوتون استجابة لمنبهات مثل الجلوكوز أو حبيبات الأنسولين عالية البوتاسيوم الممزوجة بغشاء البلازما ، يدخل SRB إلى الحبيبات ، مما يؤدي إلى ظهور بقعة فلورية مفاجئة ، قطرها حوالي 400 نانومتر. خلال الوقت المسجل ، يتم تحديد جميع أحداث exo استجابة للحافز وموقع الأحداث ووقت الظهور ومدة ونوع الاندماج. تتميز أحداث مثل KISS و Run أو الاندماج الكامل وهي ذات قيمة لتقييم أي عيب في اندماج الحبيبات في نماذج مرض السكري من النوع الثاني.
تم استخدام هذه الطريقة لإظهار أن العيب في ثقوب DB DB المصابة بالسكري هو فقدان اندماج الحبيبات الكامل وليس تغييرا في حركية اندماج الحبيبات الفردية. علاوة على ذلك ، فإن العامل الأكبر الذي يؤثر على انخفاض إفراز الأنسولين في المرض هو انخفاض عدد الخلايا المستجيبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لنضح البنكرياس وتشغيل أقل للعين من اليسار ، فئران RDB ، وأن تكون أيضا قادرا على أداء اثنين من مقالات اللسان لتقييم الاستجابات الإفرازية للحوادث داخل الجزر السليمة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
الموجز
يوضح هذا البروتوكول عزل الجزر من نموذج الفأر Lepr db لمرض السكري من النوع 2 وفحص الخلايا الحية لقياس إفراز الأنسولين باستخدام التصوير المجهري ذو الفوتونين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الغدد الصماء
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- يتميز مرض السكري من النوع 2 بإعاقة إفراز الأنسولين.
- جزر لانغرهانز ضرورية لإنتاج الأنسولين.
- يتيح التصوير المجهري ذو الفوتونين تصويرًا مفصلًا للعمليات الخلوية.
- فهم آليات إفراز الأنسولين حيوي لأبحاث السكري.
هدف الدراسة
- لعزل الجزر الحية من الفئران المصابة بالسكري.
- لتقييم إفراز الأنسولين من الخلايا بيتا داخل الجزر.
- لاستخدام تقنيات التصوير المتقدمة للتحليل في الوقت الفعلي.
الطرق المستخدمة
- تحضير خليط الإنزيم لهضم البنكرياس.
- حقن الإنزيم في البنكرياس للفئران الميتة.
- فصل وزراعة الجزر من هضم البنكرياس.
- تطبيق التصوير المجهري ذو الفوتونين لتصوير اندماج حبيبات الأنسولين.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للجزر الحية من فئران Lepr db.
- تصوير فعال لأحداث إفراز الأنسولين في الوقت الفعلي.
- رؤى حول تنظيم إفراز الأنسولين من الخلايا بيتا.
- آثار محتملة لفهم باثولوجيا السكري.
الاستنتاجات
- يعزز هذا البروتوكول فهم آليات إفراز الأنسولين.
- يوفر أداة قيّمة لأبحاث السكري.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه النتائج لاستكشاف الاستراتيجيات العلاجية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of insulin granule fusion events in intact pancreatic islets from the Leprdb mouse model of type 2 diabetes, providing a functional readout of beta-cell secretory capacity. By combining enzymatic islet isolation with live-cell two-photon imaging, the method supports mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in insulin exocytosis. The approach yields quantitative, single-event data that can inform target validation and preclinical assessment of compounds modulating insulin secretion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the hypothesis that defective full granule fusion contributes to impaired insulin secretion in diabetic models.
- Operational Value: Enables functional target validation by distinguishing between kinetic defects and loss of responsive beta cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that restore full fusion events in Leprdb islets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated, viable islets suitable for downstream compound testing in a glucose-stimulated secretion assay.
- Quantitative Output: Generates measurable exocytic event parameters (frequency, duration, location) as functional readouts for screening campaigns.
- Reproducibility: Standardized isolation and imaging procedures enable consistent data generation across experiments and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses the Leprdb model, which recapitulates key features of human type 2 diabetes, including beta-cell dysfunction.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanistic insights with preclinical evaluation of insulin secretagogues or sensitizers.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Provides functional biomarker data (fusion event incidence) to guide go/no-go decisions in preclinical development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, where isolated islets serve as a disease-relevant system for evaluating compound effects on insulin secretion prior to in vivo studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on insulin exocytosis mechanisms and pathway clarification in diabetic beta cells.
- Screening: Delivers assay-ready islets with standardized viability and responsiveness for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative, event-based readouts (e.g., full fusion incidence) that enable comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects in vitro secretory phenotypes to preclinical efficacy by modeling human diabetic beta-cell defects.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing insulin secretion across multiple diabetic models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking molecular mechanisms to functional secretory outcomes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized enzyme perfusion, density gradient purification, and imaging parameters.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by identifying secretory defects early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to restore full granule fusion in diabetic islets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, pancreatic perfusion, and enzymatic tissue dissociation.
- Depends on access to a two-photon microscope with appropriate excitation wavelengths and emission filters for SRB dye detection.
- Necessitates standardized extracellular buffer composition and glucose stimulation protocols for consistent stimulation responses.
- Involves optimization of enzyme mixture ratios and incubation times to balance islet yield and viability across genotypes.
- Limited by the technical complexity of maintaining islet integrity during imaging and the need for skilled operators to identify fusion events.
![[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56089.jpg%3Fv%3D2026-07-03T23%253A51%253A07.000Z&w=384&q=75)
