قياس أقصى قوة متساوي القياس منشأ بواسطة ألياف العضلات Permeabilized الهيكل العظمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس القدرة القصوى لتوليد القوة متساوية القياس للألياف الفردية من عينات عضلات الهيكل العظمي الكيميائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض أغشية ألياف العضلات أولا لمنظف كيميائي ، وبالتالي إزالة الحاجز بين المحتويات خارج الخلية وداخل الخلايا. الخطوة الثانية هي استخراج ألياف فردية من حزمة صغيرة من الألياف وإرفاقها بالجهاز التجريبي.

بعد ذلك ، يتم استخدام أنماط تداخل الليزر لضبط الطول الأمثل للألياف الفردية. أخيرا ، يتم إعطاء الكالسيوم لاستنباط أقصى قوة انكماش متساوية القياس. في النهاية ، توفر تقنية الألياف المفردة تقييما للخصائص الانقباضية للعضلات الهيكلية دون التعقيدات المرتبطة ببنية العضلات الكاملة.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا حيث قد يكون من الصعب تعلم الخطوات الرئيسية لتنفيذ البروتوكول بنجاح. ابدأ بإعداد حلول التشريح والتخزين والاختبار كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، استخدم الملقط لإعداد حلقات خياطة من خيوط خيوط نايلون USP 10 صفر شعيرات أحادية.

باستخدام تقنية العقدة العلوية المزدوجة ، قم بإعداد أربع حلقات لكل ألياف ليتم اختبارها. بمجرد تشكيلها ، ضع العقدة تحت المجهر وقلل حجمها إلى قطرها حوالي 750 ميكرومتر. استخدام علامات IPS GTI كدليل.

ثم قم بقص أي خياطة زائدة ، مع ترك الحلقة وذيول صغيرة بحجم 500 ميكرومتر على كلا الجانبين. انقل كتلة صغيرة من الأنسجة العضلية التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعة المفتوحة أو الإبرة إلى طبق يحتوي على محلول تشريح مبرد وأضف المزيد من محلول التشريح لضمان بقاء الأنسجة مغمورة. افحص العينة تحت المجهر وتمت معالجتها لمحاذاة المحور الطولي للألياف باتجاه الكتف الأيمن للمحقق.

ثم قم بتثبيت العينة في الطبق عن طريق تثبيتها في الزوايا باستخدام الملقط في اليد اليسرى ومقص التشريح الدقيق في اليمين. ابدأ في تشريح حزمة برفق على طول الهوامش الطولية بين الألياف. قم بإزالة والتخلص من أي أنسجة تالفة من الملقط أو المسامير.

نتيجة لعملية التشريح ، انقل الحزم من محلول التشريح إلى قارورة سعة ثلاثة ملليلتر تحتوي على 2.5 مل من محلول التشريح الطازج المبرد مع إضافة منظف غير أيوني. احتضن العينة على الجليد لمدة 30 دقيقة مع تحريك لطيف من حين لآخر وتأكد من بقاء الحزم مغمورة طوال فترة الحضانة. ثم انقل العبوات إلى قارورة تحتوي على محلول تشريح طازج وحركه برفق ولفترة وجيزة لإزالة أي منظف متبقي.

بمجرد شطفها ، انقل العبوات إلى قارورة تحتوي على محلول تخزين مبرد واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، أخرج القارورة من التخزين عند أربع درجات مئوية وانقل جميع الحزم إلى كوب دواء أو طبق تشريح. استعدادا للتخزين ، انقل الحزم إلى قوارير تبريد تحمل علامات فردية ، مملوءة ب 200 إلى 400 ميكرولتر من محلول التخزين الطازج ، وتأكد من أن الحزمة ليست عالقة على جانب الأنبوب أو تطفو على السطح.

ثم قم بتغطية الأنبوب وتخزين العينة عند سالب 80 درجة مئوية. قم بإعداد جهاز تجريبي مثل الجهاز الموضح هنا والمنسوب إليه في بروتوكول النص المصاحب. ثم املأ الغرفة التجريبية الأولى بمحلول الاسترخاء ، والغرفة الثانية بمحلول إعادة التنشيط المسبق ، والثالثة بمحلول التنشيط.

اضبط درجة الحرارة في الغرفة حتى تصبح ثابتة عند 15 درجة مئوية مع وجود الجهاز في محلول الاسترخاء. قم بربط حلقتين من حلقات الخياطة المعدة على أسطح التثبيت المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ الممتدة من كل من محول القوة ووحدة التحكم في الطول. بعد ذلك ، قم بإذابة حزمة من الألياف ذات الأهمية على الثلج لمدة 15 دقيقة تقريبا ، ثم انقلها إلى طبق بتري مطلي بالسيليكون المطلي بالسيليكون المليء بمحلول الاسترخاء الطازج المبرد.

قم بتأمين الحزمة في مكانها باستخدام دبابيس في كلا الطرفين وتأكد من غمرها باستخدام الملقط. أمسك الألياف في أحد طرفيها وابدأ في استخراجها بسلاسة على طول محورها الطولي. يجب توخي الحذر عند استخراج الألياف من الحزمة لأن الالتصاقات بين الألياف والمصفوفة خارج الخلية قد تؤدي إلى توتر مفرط ، مما يؤدي في النهاية إلى تلف ناتج عن التمدد.

بمجرد استخراجها ، أدخل الألياف في طرف ماصة معدل مع كمية صغيرة من محلول الاسترخاء وانقلها إلى الغرفة التجريبية التي تحتوي على محلول الاسترخاء الذي يوجه برفق باستخدام الملقط. قم بإزالة الألياف من طرف الماصة وتثبيتها في وحدة التحكم في الطول. باستخدام حلقة الخياطة الأولى ، قم بمعالجة الطرف الآخر من الألياف باتجاه محول القوة وقم بتأمين الألياف باستخدام نفس الإجراء.

قم بإزالة أي خياطة زائدة باستخدام مقص التشريح الدقيق. بعد ذلك ، قم بربط الحلقة الثانية فوق الأولى وقم بتثبيت الألياف عند نقطة في حدود 0.2 ملم من نهاية سطح مرفق وحدة التحكم في الطول. كرر مع الحلقة الثانية في نهاية محول القوة للألياف.

اضبط موضع وحدة التحكم في الطول في اتجاه المحور Y من أجل محاذاة الألياف بالتوازي مع الجدران الجانبية للغرفة التجريبية. ثم قم بمسح الألياف باستخدام العرض الجانبي المنشوري واضبط موضع وحدة التحكم في الطول في اتجاه المحور Z حتى تصبح الألياف موازية لأرضية الغرفة. في حالة تلف الألياف بأي شكل من الأشكال ، يجب التخلص من الألياف وإرفاق ألياف جديدة.

قم بتشغيل الليزر واضبط موضع المرحلة بحيث يمر الليزر عبر مركز الألياف. ثم اضبط طول القوس البسيط عن طريق زيادة أو تقليل التوتر على الألياف باستخدام وحدة التحكم في الطول المحور X ميكرومتر حتى يتم ملاحظة التباعد المطلوب للضوء المنعرد على الشاشة المستهدفة. بعد ضبط الطول الأمثل للقسط الساقي ، قم بقياس المسافة بين الغرز الداخلية.

ضع الغرفة بحيث يتم محاذاة الشعر المتقاطع الرأسي للعدسة على الحدود الأعمق لخياطة داخلية واحدة وصفر. تترجم القراءة الرقمية على محرك الميكرومتر المرحلة على طول المحور x بالنسبة إلى المجهر حتى يتم محاذاة الشعر المتقاطع الرأسي للعدسة مع الخيط الداخلي. ستشير الشاشة الرقمية إلى طول الألياف ، وتحافظ على الألياف بالطول المقاس ، وتستخدم الكاميرا المثبتة على المجهر لالتقاط صورة تكبير عالية للجزء المركزي من الألياف من كل من المنظرين العلوي والجانبي.

استخدم هذه الصور لحساب مساحة المقطع العرضي للألياف. استخدم برنامج التحكم في الغرفة لنقل الألياف إلى الغرفة التي تحتوي على محلول إعادة التنشيط المسبق واحتضانها هناك لمدة ثلاث دقائق. أثناء تعطيل الألياف للمحلول ، قم بقياس توترها السلبي ، ثم انقل الألياف إلى الغرفة التي تحتوي على محلول التنشيط واسمح بتطور أقصى قوة متساوية القياس كما يتضح من هضبة القوة يسبقها ارتفاع سريع.

بعد ذلك ، استخدم وحدة التحكم في الطول لتطبيق تخفيض كبير سريع وقصير في المسافة بين نقاط ربط الألياف ، متبوعا بعودة سريعة إلى الطول الأصلي لتحديد خرج محول القوة الذي يتوافق مع الصفر. القوة الموضحة هنا هي كل من المناظر العلوية والجانبية لألياف بيضاوية الشكل من هذه المشاهدات. تم تحديد مساحة المقطع العرضي عن طريق قياس الأقطار عند خمس نقاط على طول الألياف ثم حساب متوسط المناطق الخمس الناتجة.

توضح آثار القوة من ألياف العضلات البشرية والبطيئة والسريعة أن الألياف السريعة تولد قوة بمعدل أعلى من الألياف البطيئة باستخدام التقنية الموضحة في هذا الفيديو. تم قياس الخصائص النموذجية لألياف عضلات الفئران والفئران البشرية ويتم تقديمها هنا. يشير النطاق الموضح إلى الأرباع من 25 إلى 75 و N هو عدد الألياف التي تم اختبارها.

لاحظ التباين الكبير في القوة المحددة بين الأنواع المختلفة. تؤدي الإجراءات الموضحة هنا إلى تقييم القدرة القصوى للقوة الجوهرية على توليد ألياف عضلية هيكلية واحدة عن طريق إضافة تدخلات إضافية ، وجوانب مهمة من فسيولوجيا العضلات الهيكلية ، بما في ذلك من بين أمور أخرى ، قوة الطول ، وسرعة القوة ، والقوة. يمكن الكشف عن علاقات الكالسيوم.