الاستفادة من الفحص لينة آجار مستعمرة تشكيل لالتعرف مثبطات Tumorigenicity في خلايا سرطان الثدي

هنا ، نوثق استخدام مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة لاختبار تأثيرات مثبط إنزيم البيبتيلارجينين ديميناز (PADI) ، BB-Cl-amidine ، على أورام سرطان الثدي في المختبر.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تأثير العلاج كميا على قدرة الخلايا على التكاثر في مصفوفات شبه صلبة حيث أن القدرة المعززة هي السمة المميزة لعبقرية ورم الخلية باستخدام مقايسة الأجار الناعمة يتم قياس عبقرية الورم من خلال قدرة الخلية على تكوين مستعمرات داخل هلام AROS شبه صلب. نظرا لأن الخلايا غير المحولة غير قادرة على التكاثر بسرعة في هذه البيئة ، يتم إنشاء هلام AROS شبه الصلب عن طريق صنع طبقة سفلية 0.6٪ AROS أولا. بعد ذلك ، تتم إضافة خلية تحتوي على طبقة هلام AROS بنسبة 0.3٪ فوق الطبقة السفلية.

في هذا الفحص ، يتم التعامل مع الخلايا التجريبية بمثبط من البيبتيديل أو الأرجينين أو الداز أو إنزيم الوسادة الذي طوره الدكتور سوبرامانيان. كل أسبوع ، تتم إضافة طبقة تغذية إضافية ، وهي 0.3٪ جل أروس مع أو بدون علاج. الخطوة الأخيرة هي حساب عدد المستعمرات التي يزيد حجمها عن 70 ميكرومتر للتحليل.

في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المقلوب لإظهار الفرق في عدد المستعمرة بين مجموعة التحكم والعلاج. مرحبا ، اسمي Achi Huta. أنا طالب دراسات عليا في مختبر الدكتور سكوت كروس في معهد بيكر لصحة.

في جامعة كورنيل ، يمكن أن يساعد اختبار تكوين مستعمرة النمر الناعم في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا السرطان ، مثل تقييم عبقرية الورم لمجموعة واسعة من الخلايا السرطانية فيما يتعلق بحساسيتها للأدوية والهرمونات والعديد من حالات العلاج الأخرى. ابدأ هذا الإجراء بتحضير 3٪ اثنين من هيدروكسي إيثيل أروس في زجاجة زجاجية نظيفة وجافة سعة 100 مل. أضف 0.9 جرام من اثنين من هيدروكسي إيثيل أروس ، متبوعا ب 30 مل من الماء المقطر.

يسكب المزيج في الميكروويف لمدة 15 ثانية ويحرك برفق. كرر هذه الخطوة حتى يذوب مسحوق AROS تماما. بعد ذلك ، قم بالتعقيم بالمحلول الذي يحتوي على زجاجة لمدة 15 دقيقة.

اترك محلول agros يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. قبل ذلك، استخدم التدفئة المسبقة عدة ماصات سعة خمسة ملليلتر و10 ملليلتر في حاضنة 37 درجة مئوية لمنع الماصات من التصلب في الماصة. عند التعامل معها جزئيا ، قم بفك غطاء الزجاجة وقم بتسخين محلول هيدروكسي إيثيل أرو المعدة مسبقا بنسبة 3٪ لمدة 15 ثانية.

ثم حرك المحلول برفق والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى. كن حذرا عند تدوير محلول ARO لأن المحلول يرتفع عند تعرضه للهواء ويمكن أن ينسكب إذا كان هناك هلام صلب متبقي في ميكروويف الزجاجة. لبضع ثوان أخرى ، احتفظ بالزجاجة التي تحتوي على محلول ARO في حمام مائي 45 درجة مئوية خلال الخطوات التالية لمنع المحلول الزراعي من التصلب قبل الأوان.

بعد ذلك، انقل 12 مل من الوسائط الدافئة باستخدام الماصات الدافئة مسبقا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلترا. أضف على الفور ثلاثة ملليلتر من محلول 3٪ aros واقلب الأنبوب المخروطي برفق لخلط aros مع الوسائط. ثم أضف ملليلترين من هذا الخليط برفق في كل بئر من صفيحة ثقافة مكونة من ستة آبار دون تكوين أي فقاعات هواء.

احتضان صفيحة زراعة الآبار الستة أفقيا على سطح مستو عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للخليط بالتصلب. بعد أن يتماسك الخليط ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة السفلية جاهزة الآن للاستخدام.

يتمثل أحد الجوانب الصعبة في هذا الإجراء في التأكد من توزيع جميع الخلايا بالتساوي وأن قشرة الأغرا المذابة لا تتصلب قبل إضافتها إلى كل بئر لضمان خلط المياه الغازية في الوسائط قبل إضافة الجل الزراعي السائل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تسخين الأنابيب مسبقا لتجنب تصلب المحاليل أثناء المناولة. لتحضير الخلية التي تحتوي على طبقة ، قم أولا بعيون التربسين MCF 10 خلايا DCIS وتخفيفها إلى تركيز خلية يبلغ 40،000 خلية لكل مليلتر ، ثم خذ ثمانية ملليلتر من الوسائط باستخدام ماصات دافئة ونقلها إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلترا.

أضف على الفور ملليلترين من 3٪ aros إلى الأنبوب المخروطي واقلبها برفق لخلط aros مع الوسائط. تجنب تكوين أي فقاعات. بعد ذلك ، خذ ملليلترين من الخلايا وعالجها باثنين من كلورامين BB ميكرومولار في DMSO أو DMSO وحده كعنصر تحكم بعد العلاج ، امزج الخلايا مع 0.6٪ aros في تخفيف واحد لواحد لعمل تركيز نهائي من كلورامين BB ميكرومولار.

ثم خذ ملليلترا واحدا من خليط الخلية وأضفه برفق إلى الطبقة السفلية من لوحة ثقافة الآبار الستة. ضع صفيحة زراعة الآبار الستة أفقيا على سطح مستو عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للطبقة العليا بالتصلب. بعد أن يتماسك الخليط ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة أسبوع قبل إضافة طبقة التغذية.

ابدأ في تحضير طبقة التغذية عن طريق وضع محلول هيدروكسي إيثيل أرو المصنوع مسبقا بنسبة 3٪ كما كان من قبل وموازنة زجاجة المحلول الزراعي في حمام مائي 45 درجة مئوية ، امزج ملليلترا واحدا من محلول زراعي 3٪ مع تسعة ملليلتر من الوسائط الدافئة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر واقلبها برفق لخلط الأروس مع الوسائط. تجنب تكوين فقاعات الهواء. بعد معالجة الخليط ب BB chloramine ، أضف ملليلترا واحدا من الخليط برفق في كل بئر من صفيحة ثقافة الآبار الستة التي تحتوي على القاع والطبقات الناعمة.

ثم ضع صفيحة زراعة الآبار الستة أفقيا على سطح مستو عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخليط بالتصلب. بعد أن تصلب طبقة التغذية ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. بدر ، كرر إجراء التغذية هذا أسبوعيا عن طريق تراكب مليلتر واحد من محلول المعالجة المتوسطة الزراعية بنسبة 0.3٪ على طبقة التغذية الحالية لتجديد الخلايا بوسائط جديدة حتى يتم ملاحظة تكوين المستعمرة.

بعد أسبوعين ونصف من نمو الخلايا في الأجار الناعم ، يتم حساب عدد المستعمرة في كل بئر. باستخدام مجهر ضوئي لتسهيل القياس الكمي ، اطبع شبكة على شفافية وقم بإرفاق الشبكة بلوحة الآبار الستة للمساعدة في تحديد مكان وجود الخلايا أثناء العد. يتم تحديد حجم المستعمرة حسب قطر كل مستعمرة وسيختلف في تحديد حجم المستعمرة المرجعية مسبقا لتحديد المستعمرات التي سيتم تسجيلها.

على سبيل المثال ، هنا ، يتم تضمين أحجام المستعمرات التي يبلغ حجمها 70 ميكرومترا أو أكبر في تحليل البيانات. بعد العد ، قم بإغلاق لوحة ثقافة الآبار الستة مع الطفيل لمنع المواد الهلامية من الجفاف. قم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية لمنع المزيد من تكوين المستعمرات والعد في المستقبل.

تظهر النتائج أن كلورامين BB يثبط بشكل كبير تكوين مستعمرات مشتقة من خلايا MC 10 DCIS في وجود مثبط وسادة. كان هناك انخفاض في كل من تكوين المستعمرة وحجم المستعمرة عند مقارنتها بالتحكم في DMSO. كان حجم مستعمرات خلايا MCF 10 DCIS المعالجة ب BB الكلورامين في الغالب في حدود 20 إلى 100 ميكرومتر.

بينما أظهر حجم مستعمرات التحكم في DMSO نطاقا أكبر من 70 إلى 150 ميكرومتر بعد أسبوعين ونصف من النمو ، تم حساب وتحليل مستعمرات أكبر من 70 ميكرومتر. كان هناك ما معدله حوالي 3,500 مستعمرة في السيطرة DMSO ، في حين شوهدت ما يقرب من 2000 مستعمرة فقط في المجموعة المعالجة ب BB الكلورامين. بعد أسبوعين ونصف من الزراعة اللينة ، يمثل هذا انخفاضا بنسبة 44٪ في متوسط تكوين المستعمرة في وجود ميكرومولار واحد BB Chloramine مما يشير إلى تثبيط كبير للورم لخلايا سرطان الثدي بواسطة مثبط الفوطة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك تسخين جميع الكواشف والمعدات مسبقا لتجنب تصلب المحاليل عند المناولة ، وشكرا على المشاهدة.