تحليل وظائف الخلايا الصاري في فيفو باستخدام 'الصاري خلية طرق في' الفئران

الهدف العام من الطريقة التالية هو تحليل وظائف الخلايا البدينة في الجسم الحي باستخدام الفئران البدينة التي تضربها. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد الخلايا البدينة المستمدة من نخاع العظام أولا ، أو BMC MCs أو النقش في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا البدينة. في الخطوة الثانية ، يتم نقل BMC MCs بالتبني إلى مواقع تشريحية مختلفة في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا البدينة لتوليد فئران الخلايا البدينة.

في النهاية ، يتم تقييم الأعداد والتوزيع التشريحي للخلايا البدينة المنقولة بالتبني عن طريق قياس التدفق الخلوي والتحليل الكيميائي المناعي لتقييم مدى تشابه المجموعات المطعمة مع تلك الموجودة في الفئران البرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتقييم المباشر لوظائف نوع الجدار المطعمة أو مجموعات خلايا MA المعدلة وراثيا في الجسم الحي. لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا خلايا MA ، مثل إلى أي مدى يمكن أن تساهم خلايا MA أو منتجاتها في ميزات نماذج الفئران للعمليات الفسيولوجية أو المناعية أو المرضية ، بما في ذلك نماذج الأمراض البشرية.

بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الذين يتعلمون هذه الطريقة لأن تطعيم الخلايا البدينة ونقصها يمكن أن يختلف اعتمادا على الطريقة المستخدمة لتوليد BM CMCs وجذر الحقن وعدد BMC MCs المحقونة وعدد الأسابيع التي يتم حقنها بعد النقش قبل إجراء التجارب في الجسم الحي. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم جوانب إجراء النقش ما لم يرى المرء بالضبط كيف يتم إجراؤها. لاستخراج نخاع العظم أولا ، استخدم أدوات تشريح معقمة لحصاد عظم الفخذ والساق والشظية من الفئران البرية دون التعرض لأي مشاشية في العظام.

عندما يتم تشريح كل عظم ، قم بتثبيته بالملقط واكشط كل الأنسجة الخارجية. ثم ضع العظم في PBS على الجليد عندما يتم جمع كل العظام ، وانقلها إلى غطاء مزرعة الأنسجة المعقم ، ثم واحدا تلو الآخر ، وقم بتأمين كل عظم بالملقط وقطع كلا المشاشية لفضح التجاويف النخاعي. بعد ذلك ، باستخدام ثلاث محاقن مليلتر ، مزودة بإبر قياس 30 ووسط بارد للتنظيف ، كل النخاع الأحمر من كل عظم في طبق بتري جديد عندما يتم مسح جميع العظام ، استخدم نفس المحقنة لفصل مجموعات خلايا نخاع العظم عن طريق الشفط والطرد اللطيف المتكرر.

ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. املأ الأنبوب بوسط التنظيف البارد وقم بالطرد المركزي للخلايا العصيية. قم بتعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من وسط الزراعة.

ثم انقل خلايا نخاع العظم إلى قارورة مزرعة أنسجة ذات حجم مناسب. بعد يوم إلى يومين من الثقافة ، انقل الخلايا غير اللاصقة إلى قارورة جديدة مع 10 ملليلتر من الثقافة الطازجة ، متوسطة لكل فأر خلال الأسابيع التالية. يتم عرض إطعام الخلايا كل ثلاثة إلى أربعة أيام فقط.

نقل الخلايا غير اللاصقة إلى قارورة جديدة مرة واحدة في الأسبوع حتى لا تترك خلايا الالتصاق للنقش داخل الأدمة في دبوس الأذن Resus. قم بتعليق BMC MCs أربعة في 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر في DMEM البارد. ثم استنشق الخلايا في حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 30 وضع المحقنة على الجليد.

بعد ذلك ، تأكد من عمق التخدير المناسب عن طريق قرصة علوية من فأر متلقي يعاني من نقص الخلايا البدينة الذي يعاني من أربعة إلى ستة أسابيع وقم بتطبيق مرهم العين لحقن الخلايا. استخدم السبابة لكشف وتمد الوجه البطني لدبابة الأذن ، مما يخلق ضغطا رأسيا على الوجه الظهري للأذن. ثم قم بإعطاء 1 25 ميكرولتر حقن داخل الأدمة من واحد في 10 إلى ستة BMC MCs في منتصف الأذن ، وحقن ثان 25 ميكرولتر من نفس الشيء باتجاه طرف الدبوس.

بالنسبة إلى داخل الصفاق ، قم بإعادة تعليق BMC MCs في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر في DMEM البارد. ثم استخدم حقنة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 25 لحقن مرتين 10 إلى ستة CMCs BM في 200 ميكرولتر من الوسط في التجويف البريتوني لمتلقي نقص الخلايا البدينة للنقش في الوريد. قم بتعليق BM CMCs عند 2.5 مرة 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر في DMEM البارد ، ثم حقن خمس مرات 10 إلى ستة BMC MCs في 200 ميكرولتر من الوسط عبر الوريد الذيل.

بعد أربعة إلى ستة أسابيع من النقش داخل الصفاق ، استخدم حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 25 لحقن خمسة ملليلتر من PBS البارد في التجويف البريتوني للحيوان المتلقي. دلكي البطن لمدة 20 ثانية لحصاد الخلايا الصفاقية. ثم استخدم حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 22 لشفط الغسيل البريتوني ببطء.

يمكن بعد ذلك تقييم النسبة المئوية للخلايا البدينة والعدد الكلي للخلايا في سائل الغسيل البريتوني عن طريق قياس التدفق الخلوي أو كيمياء التشريع. لتقييم الخلايا البدينة في النوافذ المساريقية ، افتح الغشاء البريتوني لكشف الأمعاء. رتب أربع إلى خمس نوافذ مساريقية لكل فأرة على شريحة متبوعة بتثبيت لمدة ساعة واحدة في محلول ضوضاء السيارة.

أضف درجة حرارة الغرفة في نهاية الحضانة ، وجفف الشرائح بالهواء وقم بإزالة الأمعاء. ستظل النوافذ المساريقية الثابتة متصلة بالشرائح. أخيرا ، تلطيخ المستحضرات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بمحلول تلطيخ تشابا يمثل تحليل قياس التدفق الخلوي وتلوين الطعم الأزرق لمحبو الدم CMCs بعد 15 و 45 يوما من الثقافة في DMEM ، مكملة ب IL ثلاثة تظهر BM CMCs المزروعة لمدة 45 يوما و 95٪ نقية وتحتوي على أعداد كبيرة من الحبيبات السيتوبلازمية.

لذلك ، فإن الخلايا من هذه الثقافات مناسبة لتجارب النقش ، في حين أن الخلايا المزروعة لمدة 15 يوما ليست في هذه الصور. يظهر النقش الناجح لقرش الأذن بعد أربعة أسابيع من النوافذ المساريقية داخل الأدمة والنقش والتجويف البريتوني بعد ستة أسابيع من النقش داخل الصفاق والرئة بعد 12 أسبوعا من النقش الوريدي كما هو متوقع. توجد الخلايا البدينة في عينات الأنسجة المعزولة من الفئران البرية ، بينما لم يتم اكتشاف أي خلايا بدينة في التي تعاني من نقص الخلايا البدينة في الفئران ذات الخلايا البدينة.

ومع ذلك ، تظهر BMC MCs المنقولة بالتبني في مواقع مماثلة لتلك التي لوحظت في البرية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك أن الفترة الفاصلة بين النقش ودراسة التجربة ستختلف اعتمادا على موقع حقن الخلايا البدينة. من المهم جدا احترام مثل هذه الفترات الزمنية لإتاحة الوقت الكافي للخلايا المطعمة لتنضج وتأخذ الموقع النهائي في الجسم الحي.

قدم هذا النهج ولا يزال يوفر معلومات مهمة حول ما يمكن أن تفعله الخلية الجماعية ومنتجها أو لا يمكن أن تفعله في الجسم الحي. يرجى دائما أن تضع في اعتبارك أن العمل مع الحية يتطلب تدريبا محددا ومراجعة مناسبة وموافقة على البروتوكولات التجريبية والالتزام الصارم بأعلى معايير رعاية ، بما في ذلك الحرص على تقليل ألم وإجهاده عند تنفيذ هذه الإجراءات.