المذنب الفحص كتدبير غير مباشر من الجهازية الاكسدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام مقايسة COMET للقياس غير المباشر للإجهاد التأكسدي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الكريات البيض أولا من عينات الدم البشري. الخطوة الثانية هي خلط الخلايا ذات الذوبان المنخفض وشل حركة الخلايا على الشرائح.

بعد ذلك ، يتم تحلل الخلايا لمدة ساعتين ، متبوعا بالرحلان الكهربائي بعد تلطيخ الشرائح ببروميد الديم. يتم تصور الحمض النووي عن طريق الفحص المجهري الفلوري. في النهاية ، يتم تحديد فواصل الحمض النووي عن طريق تحليل البرامج لبيانات الفحص المجهري الفلوري.

نعلم اليوم أن الإجهاد التأكسدي يلعب دورا مهما في التسبب في مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك بالطبع أمراض العيون. هناك العديد من الطرق المختلفة لقياس الإجهاد التأكسدي. إحدى طرق قياسه بشكل غير مباشر هي عن طريق فحص comit.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها تكتيك بسيط ومنخفض التكلفة وموثوق يمكننا من خلاله قياس الإجهاد التأكسدي بشكل غير مباشر. سيتم عزل كريات الدم البيضاء في لوكاس لهذه التجربة من عينات الدم البشرية التي تم الحصول عليها بمضاد للتخثر عن طريق البزل الوريدي لفصل الخلايا الليمفاوية ، وتخفيف الدم أولا بنسبة واحد إلى واحد باستخدام PBS. ثم ضع طبقة من 600 ميكرولتر من سائل فاصل الخلايا المتدرج الكثافة ، مثل جهاز الطرد المركزي بحزمة هيستو عند 1 ، 800 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بشفط طبقة Buffy إلى ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي PBS عند 300 جم لمدة 10 دقائق. لحنك الخلايا الليمفاوية باستخدام ماصة ، استرجع الخلايا الليمفاوية من أعلى الحدود بين PBS وسائل فاصل الخلايا. قم بإزالة نطاقات الكريات البيض من الواجهة بين البلازميد والطبقات السائلة لفاصل الخلية لكل أنبوب وجمعها في أنبوب واحد سعة 50 ملليلترا.

ارفع الحجم الإجمالي إلى 50 مل مع PBS البارد. اغسل معلق الخلية ثلاث مرات باستخدام PBS عند 300 جم لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل الثالث ، احسب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

قم بتعليق الخلايا في PBS و Eloqua في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 10 ملايين خلية لكل ماصة أنبوبية. أشر أربعة ملليلتر من الخلايا في أنبوب بلاستيكي يمكن التخلص منه سعة 1.5 مل. أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى 500 ميكرولتر من درجة حرارة تبلور منخفضة بنسبة 1٪.

Aros عند 40 درجة مئوية ، محضرة مسبقا ، تمزج ماصة 50 ميكرولترا من تعليق الخلية بسرعة على السطح المغطى ب agros لشريحة مطلية مسبقا. اترك agros يتجل لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. كن متسقا مع الوقت ودرجة الحرارة المستخدمة في الجل ، وتأكد من ضبط agros بالكامل قبل الشروع في إجراء التحلل.

بمجرد ضبط agros بالكامل ، اغمر الشرائح في محلول للتحلل عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح برفق من محلول التحلل. ضع الشرائح جنبا إلى جنب على صندوق جل أفقي بالقرب من أحد طرفيها ، وحركها بالقرب من بعضها قدر الإمكان.

املأ الخزانات العازلة برحلان كهربائي حديث الصنع ، عازلة لدرجة الحموضة أكبر من 13. لاحظ أن الإجراء الموضح هنا هو للرحلان الكهربائي. في ظل الظروف القلوية ذات الرقم الهيدروجيني أعلى من 13 ، املأ الخزانات العازلة حتى يغطي مستوى السائل الشرائح بالكامل.

تجنب الفقاعات فوق الحشارة. دع الشريحة تجلس في المخزن المؤقت القلوي لمدة 20 دقيقة للسماح بفك الحمض النووي والتعبير عن تلف المختبر القلوي. بعد 20 دقيقة ، قم بتشغيل مصدر الطاقة إلى 25 فولت واضبط التيار على 300 مللي أمبير عن طريق رفع مستوى المخزن المؤقت أو خفضه.

ينزلق الرحلان الكهربائي لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بإيقاف تشغيل الطاقة. ارفع الشرائح برفق من المخزن المؤقت وضعها على صينية تصريف بطريقة متساقطة ، وقم بتغطية الشرائح بمخزن مؤقت للتحييد.

اسمح للشرائح بالجلوس لمدة خمس دقائق على الأقل. قم بتصريف الشرائح وكرر الطلاء باستخدام مخزن مؤقت للتعادل مرتين أخريين. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الشرائح بملليلتر واحد من بروميد إيثريوم لمدة خمس دقائق.

ارتد قفازات واقية لأن بروميد آهي مادة مسرطنة معروفة. بعد خمس دقائق ، اغمس الشرائح في الماء المقطر المبرد لإزالة أي بقعة زائدة. ثم ضع غطاء على كل شريحة.

قم بتخزين الشرائح على الفور. يمكن تخزين شرائح البقع لمدة شهر عند أربع درجات مئوية في ظروف جافة. لتصور تقييم تلف الحمض النووي ، لاحظ شريحة الحمض النووي الملطخة ببروميد الأثيريوم تحت مجهر فلوري موضوعي 40 ×.

اضبط الأداة الآلية التي تقوم بالمسح الضوئي عبر المجهر ، وقم بتمرير الخلايا في فحص المذنب وتصويرها. تم تقييم تلف الحمض النووي كميا في الخلايا عن طريق قياس طول هجرة الحمض النووي والنسبة المئوية للحمض النووي المهاجر. يشير رأس السهم الأسود إلى مذنب نموذجي برأس وذيل مشرقين.

يتكون الرأس من الحمض النووي غير التالف السليم ، ويتكون الذيل من شظايا الحمض النووي التالفة الأصغر. على الرغم من أن اختبار COMET يقدم نتائج قابلة للتكرار ، إلا أنه يمكن أن يتأثر بمجموعة متنوعة من العوامل مثل ما إذا كان الاختبار يتم إجراؤه على الكريات البيض المحضرة حديثا. في هذا الرسم البياني ، يتم تعريف عزم الذيل على أنه ناتج طول الذيل والذيل.

تظهر نسبة الحمض النووي لإجمالي الحمض النووي من مجموعة الكريات البيض التي تم حفظها بالتبريد قبل التحلل والرحلان الكهربائي فواصل حمض نووي أحادية الشريطة أعلى بكثير من الكريات البيض المعدة حديثا من المجموعة الأولى. يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار لتقييم الإجهاد التأكسدي الجهازي بشكل غير مباشر. هنا ، تمثل عزم الزيتون ناتج النسبة المئوية للحمض النووي الكلي في الذيل والمسافة بين مراكز كتلة مناطق الرأس والذيل.

تكشف النتائج من العمر والجنس المتطابقين مع المدخنين والأشخاص الأصحاء أن تدخين نصف علبة سجائر يوميا يزيد عن ضعف عدد فواصل الحمض النووي المفردة التي تقطعت بهم السبل في الكريات البيض المنتشرة بمجرد إتقانها. تتمتع هذه التقنية بالعديد من المزايا ، بما في ذلك تكلفتها المنخفضة نسبيا ، وعدد الخلايا الصغير ، وبالتالي عينة الدم الصغيرة المطلوبة لكل مريض ، بالإضافة إلى الفترة الزمنية القصيرة نسبيا المطلوبة لتحديد تلف الحمض النووي في الخلايا.