الهجين التصوير μCT-FMT وتحليل الصور

يُعد التصوير المقطعي المعتمد على الفلورة تقنية تصوير عالية الحساسية للتقييم الكمي لتوزيع الفلورة. وتتوفر العديد من المجسات الفلورية المستهدفة للاستخدام في الفئران المخدرة، والتي تسمح بتصوير تكوين الأوعية الدموية، والموت الخلوي المبرمج، والالتهابات، وغيرها. سنوضح في هذا الفيديو كيفية إجراء التصوير الهجين باستخدام FMT وMicro City في معهدنا.

في الفصل الأول، الأجهزة، هذا هو جهاز الـ F-M-T، حيث ترمز F-M-T إلى التصوير المقطعي الجزيئي الفلوري. وتعني كلمة "مقطعي" أنه يتم إنشاء صور ثلاثية الأبعاد. ويتميز الـ FMT بحساسية عالية لتصوير الفلورة الذاتية القريبة في الفئران.

الآن تم فتح اللوحة الأمامية لإظهار الجزء الداخلي من نظام FMT. يوجد في الأسفل ليزر مثبت على خادم ثنائي الأبعاد (2D server). يرسل الليزر الضوء إلى الفأر، الذي يتم تثبيته في سرير فأر شفاف جزئياً.

توجد فوق سرير الفأر مصفوفة من صمامات LED كمصدر ضوء بديل، مما يسمح لجهاز التصوير الفلوروسنتي متعدد الأطوال الموجية (FMT) بالعمل كجهاز تصوير انعكاسي عادي. وتم تركيب عجلة الفلتر أسفل العدسة، التي تلتقط الضوء للمكشاف الموجود في الجزء العلوي من الجهاز. هذا هو جهاز التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro ct) الخاص بنا.

تم تجهيز جهاز التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro CT) بأنبوبي أشعة سينية وكاشفين بلوحيين مسطحين، مما يسمح بالحصول على عمليات مسح ثنائية الطاقة. الفصل الثاني، بروتوكول مسح FMT باستخدام micro CT. تم تصميم كل من FMT وmicro CT لتصوير الفئران، وقبل البدء في التصوير يتم تخدير الفئران باستخدام isof fluorine.

من أجل إجراء مسح FMT، يجب إزالة شعر الفأر، وهو أمر يتم بنجاح باستخدام كريم herring. قد تصاب بعض سلالات الفئران بطفح جلدي نتيجة استخدام كريم deha؛ لذا، يوصى بمراقبة الفئران لرصد أي تغيرات جلدية والتواصل مع الطاقم البيطري لتقديم الرعاية اللازمة عند الحاجة.

علاوة على ذلك، اختبر مدى التحمل على دفعة صغيرة من أي سلالات جديدة من الفئران في البداية. ولتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم، يتم وضع الفأر على وسادة تدفئة. ولحقن المادة المباينة، يتم وضع قسطرة في وريد الذيل نظراً لصغر الحجم.

تُعد هذه العملية صعبة للغاية وتتطلب بعض الخبرة. إذا تدفق الدم عائداً إلى القسطرة، فهذا يعني أنها وُضعت بشكل صحيح عبر القسطرة. يمكن حقن عوامل التباين الفلورية وعوامل التباين للتصوير المقطعي المحوسب (CT) لتجنب زيادة تحميل الحجم.

يجب ألا يتجاوز حجم الحقن 5 mL لكل كيلوغرام من وزن الجسم، وهو ما يعادل 150 µL لفأر يزن 30 g. ولأغراض المسح، يتم وضع الفأر داخل سرير فأر متعدد الوسائط.

قد يكون هناك بعض الرموز المرسومة على ذيل الفأر لغرض التعريف. ومن المهم تجنب وضع مثل هذه الرموز على الجذع لأن ذلك قد يؤثر على المسح الضوئي. يتم إغلاق سرير الفأر وضبط العمق لتثبيت الفأر بإحكام في وضعية ثابتة.

يجب توخي الحذر ومراقبة التنفس لأن شد السرير بإفراط قد يؤدي إلى اختناق الفأر. تُستخدم الفئران العارية بشكل شائع في أبحاث الأورام بسبب تثبيط مناعتها. وتعد حقيقة كونها عارية أثراً جانبياً محظوظاً للطفرة الجينية.

وبناءً على ذلك، يمكن الاستغناء عن إجراء إزالة الشعر الشاق. يجب التأكد من أن الفأر يتنفس بشكل صحيح، وعند الضرورة، يتم ضبط سرير الفأر وفقاً لذلك. ثم يوضع سرير الفأر داخل جهاز micro ct.

يتم تحويل الأنابيب التي تنقل غاز الفلور ISO للحفاظ على تدفق الغاز داخل الجهاز. بعد ذلك، يتم إغلاق micro C لتفعيل درع الحماية من الأشعة السينية. ولن يبدأ micro C في عملية المسح إلا إذا كان الغطاء مغلقاً.

باستخدام الأزرار الموجودة في جهاز micro CT، يمكن تحريك الفأر إلى داخل جهاز micro CT. وفي جهاز كمبيوتر التحكم الخاص بـ micro CT، يتم الحصول على صورة topo gram وعرضها، ثم يتم ضبط إعدادات التظليل (windowing settings) لرؤية الفأر بشكل أفضل. يمكن تحديد مسح ZUP واحد أو أكثر، ويُشار إلى مواقع هذه المسوحات بالمناطق ذات اللون الأزرق الفاتح.

عادةً ما تكون عملية مسح ZUP من مرة واحدة إلى ثلاث مرات كافية. بعد بدء المسح، يظهر التقدم عبر أشرطة تقدم باللون الأزرق الداكن. يقوم جهاز micro CT ذو اللوحة المسطحة لدينا بإجراء مسوحات ZUP بالتتابع، وهو ما يختلف عن التصوير المقطعي المحوسب الحلزوني السريري.

باستخدام الأزرار، يتم تحريك سرير الفأر إلى الأمام. مرة أخرى، يتم فتح غطاء الحماية وتبديل أنابيب التخدير. يتم إخراج الحامل بعناية من سرير الفأر وسحب أنبوب التخدير للخارج.

يعد هذا الأمر ضرورياً لأن جهاز AN وجهاز FMT لا يعتمدان على هذا الأنبوب الصغير. وبدلاً من ذلك، يتم غمر الغرفة الصغيرة الموجودة داخل جهاز FMT بغاز التخدير. الآن، يتم نقل سرير الفأر الذي يحمل الفأر إلى جهاز FMT ويتم إدخاله في جهاز الكمبيوتر الخاص بالتحكم في FMT.

يتم ضبط مجال رؤية المسح بالإضافة إلى كثافة أخذ العينات. وعادةً ما يتم استخدام حوالي 120 نقطة. يبدأ المسح بعد الضغط على الزر.

تكتسب المرحلة الأولى من التصوير المقطعي الفلوري (FMT) صورة إضاءة نافذة أو صورة استثارة لكل نقطة من نقاط مصدر الليزر. ويظهر ذلك في هذا المقطع بوضع التسريع، بينما تستغرق العملية عادةً حوالي خمس دقائق.

يمكنكم ملاحظة أن كمية الضوء التي تمر عبر الجزء العلوي من الجسم أقل بكثير مقارنة بالجزء السفلي. ويرجع ذلك إلى أن الأعضاء ذات حجم الدم النسبي الأعلى، مثل القلب والكبد والكلى، تتركز بشكل أكبر في الجزء العلوي من الجسم. ويعد الدم الممتص الرئيسي للأشعة تحت الحمراء القريبة.

تُجري عملية المرور الثانية على نفس نقاط المصدر باستخدام مرشح مختلف، والذي يسمح فقط بمرور الضوء الفلوري عبر الفصل الثالث، الزيت التفاعلي والتقسيم. ولدمج البيانات من كلا الجهازين، تُستخدم علامات مدمجة في قاعدة الفأر.

تظهر العلامات أيضاً في صورة انعكاسية تم الحصول عليها بواسطة FMT. هذه العلامات هي في الواقع مجرد ثقوب بسيطة ولا تحتاج إلى ملئها بأي مادة فلورية أو مادة تباين للأشعة المقطعية CT. وقد قمنا في معهدنا بتطوير برنامج برمجي يقوم بعملية اكتشاف العلامات ودمجها تلقائياً.

يتم تقدير شكل الفأر، بالإضافة إلى خرائط الامتصاص والتشتت غير المتجانسة تلقائياً باستخدام بيانات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro CT) كما هو موضح في منشورنا الأخير في مجلة Theranostics. وتعد هذه المعلمات مهمة لإعادة البناء الكمي للفلورة. ولقياس التوزيع الحيوي للفلورة، يلزم إجراء تقسيم للأعضاء.

نقوم بإنشاء هذا التقسيم بشكل تفاعلي باستخدام برنامج يُدعى imulitic preclinical تم تطويره في معهدنا كما يظهر في الآتي. يتم عرض عملية التقسيم هذه بنظام التسريع، ويمكن للشخص الخبير تنفيذها في غضون 10 إلى 20 دقيقة تقريباً. أولاً، يتم تحميل مجموعة بيانات الـ CT.

يمكن فحصه ثلاثي الأبعاد باستخدام تصيير السطح المتساوي (ISO surface rendering). ومن خلال تغيير إعدادات النافذة، يمكن تغيير قيمة ISO. على سبيل المثال، لتصور عظام جسم الفأر بالكامل مع سرير الفأر، يتم تحميل التراكب (overlay).

تظهر الإشارة في هذا المثال في المثانة. والآن يتم إيقاف تشغيل تصور التراكب، وذلك للتركيز على التجزئة التشريحية.

في مسوحات microt الأصلية، يمكن العثور على الرئة بسهولة بسبب التباين السلبي القوي مقارنة بالأنسجة الرخوة الأخرى. أما الهيكل الكبير الموجود داخل الرئة فهو القلب. لنقم بتجزئة الرئة أولاً.

يتم تقسيم جميع وحدات الـ voxels التي تقل عن قيمة معينة باستخدام عملية العتبة (thresholding)، وتظهر هذه الوحدات باللون الأخضر. وتعتبر الرئة منطقة متصلة، يمكن فصلها باستخدام عملية التعبئة (filling operation).

على غرار أداة دلو الطلاء؛ ففي برنامج الرسم، يمكن فصل القصبة الهوائية عن الرئة عن طريق القص والملء. أما الأعضاء المحدبة، مثل المثانة، فيمكن تقسيمها عن طريق رسم خطوط عشوائية لتحديد حدود العضو.

تتم إضافة المزيد من الخربشات حتى يتم الوصول إلى دقة كافية. يمكن تقسيم الأعضاء غير المحدبة، مثل الأمعاء، جزءًا تلو الآخر. يظهر الكبد كمنطقة متجانسة ويمتلك بنية أكثر تعقيدًا.

نظرًا لأنها تتكون من فصوص متعددة، يمكن حفظ عملية التجزئة على القرص وتحميلها في البرنامج. وباستخدام عملية التجزئة هذه، يمكن تعيين الإشارة الفلورية للأعضاء. يقوم البرنامج بحساب هذه الكميات وحفظها في ورقة إضافية؛ وبالنسبة للمسوحات الطولية، يجب إجراء عملية التجزئة لكل نقطة زمنية مرة أخرى، لأن الفترات تكون عادةً طويلة جدًا بحيث لا يمكن الإبقاء على الفأر تحت التخدير في وضع ثابت.

لذلك، تُعد عملية التجزئة مهمة شاقة إذا كان هناك عدد كبير من الفئران ونقاط زمنية متعددة. ولتكميم النتائج، قم بتحميل تراكب وتجزئة. انقر فوق تعيين إعدادات الدفعة (set Batch settings) لتمكين البرنامج من تذكر الإعدادات الحالية.

الآن، انقر فوق "batch statistics" لتوجيه البرنامج لحساب القيم لجميع المناطق في جميع مسوحات micro CT FMT. ستستغرق هذه العملية بضع ثوانٍ، ثم يتم حفظ الإحصائيات في ملف جدول بيانات واحد.

يعد هذا الأمر مريحاً لأنه يعفي المستخدم من دمج عشرات الملفات بنفسه. وبناءً على هذا الملف، يمكن حساب منحنيات الأعضاء. الفصل الرابع، النتائج التمثيلية.

لاختبار ما إذا كان الدمج يعمل بشكل صحيح، استخدمنا نموذجاً وهمياً من الأروس. تمت إضافة بعض مسحوق أكسيد التيتانيوم لغرض التشتت. ولتحقيق شكل غير منتظم، قمنا بقص بعض الأجزاء.

تم دمج العديد من الاشتمالات الصغيرة المليئة بفلورسنت وعامل تباين للتصوير المقطعي المحوسب (CT) في النموذج المحاكي. ونظراً لأن التصوير المقطعي الفلوريسنتي (FMT) لا يعرف الشكل الحقيقي للجسم ويفترض شكلاً مبسطاً، فإن إعادة البناء لا تكون دقيقة للأجسام ذات الأشكال غير المنتظمة. لذلك، قمنا بتنفيذ عملية إعادة بناء أخرى تستخدم الشكل المشتق من بيانات المدينة المجهرية (micro city).

كما تلاحظون، فإن تحديد موقع الإشارة في النموذج المحاكي (phantom) أفضل بكثير. لفحص البيانات الحيوية (in vivo)، دعونا نمر عبر النقاط الزمنية للتصوير. هذا هو المسح المسبق.

ما نراه هو أساساً مجرد ضوضاء وشوائب تصويرية. وإذا انتقلنا إلى النقطة الزمنية التالية، وهي النقطة التي تلي الحقن، سنلاحظ إشارة أقوى بكثير، ولكن إعدادات التباين والسطوع (windowing) حادة للغاية. يمكنك تعديل إعدادات التباين والسطوع باستخدام مربع حوار التباين والسطوع.

نلاحظ معظم الإشارة في المثانة. وإذا انتقلنا إلى الوقت التالي، بعد 0.2 ساعة من الحقن، نرى بعض الإشارة خارج جسم الفأر. ويرجع ذلك إلى أن الفأر قد تبول المادة الفلورية على سرير الفأر.

من خلال إجراء مزيد من الضبط للنوافذ (windowing)، يمكننا ملاحظة بعض الإشارات عند العمود الفقري والركبتين. والآن، لننتقل إلى الوقت 0.4 ساعة بعد الحقن؛ نجد أن الإشارة الصادرة من البول قد اختفت الآن، ونلاحظ وجود الفلورية عند العمود الفقري والركبتين في النقاط الزمنية التالية، وهي 6 ساعات و24 ساعة بعد الحقن، حيث نرى النتيجة ذاتها.

لننتقل الآن إلى الأنف التالي. لا يُظهر المسح المسبق أي شيء باستخدام إعدادات النافذة هذه. بينما يُظهر المسح الذي تم بعد 15 دقيقة من الحقن إشارة قوية في المثانة وهكذا.

وجدنا في هذه الدراسة تركيزات عالية في المثانة البولية بعد فترة وجيزة من الحقن، نتيجة للإفراز الكلوي السريع لهذا المسبار. علاوة على ذلك، ترتفع الإشارة في العمود الفقري بسرعة وتظل مستقرة نسبياً خلال النقاط الزمنية اللاحقة للتصوير. الفصل الخامس، الخاتمة.

وفي الختام، قمنا بعرض بروتوكول تصوير متعدد الوسائط للجمع بين نقاط القوة في التصوير الفلوري، والتصوير المقطعي الجزيئي، والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق. تتيح بيانات micro CT التشريحية تحسين إعادة بناء الصور الفلورية من خلال استخدام شكل الفأر. علاوة على ذلك، فإن هذه البيانات مفيدة في إنشاء تقسيمات للأعضاء، وهي ضرورية لاستخراج قياسات كمية من بيانات الصور.