عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مصائد العدلات خارج الخلية ، أو NETs ، المنبعثة من العدلات البشرية على نطاق إنتاجية عالية. يمكن أن تساعد الطرق المعروضة هنا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الالتهاب وتغيير الأمراض الالتهابية من خلال دراسة آلية وتنظيم تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية في المختبر في العدلات البشرية. تتضمن الآثار المترتبة على هذه التقنية تحديد مسارات إشارات وسيطة NET مركزية وجزيئات مثبطة أو محفزة NET.

لعزل العدلات عن الدم ، قم بنقل 20 مل من دم الإنسان إلى أنابيب مخروطية سعة 250 مل. أضف 10 مل من 6٪ ديكستران ، ثم اخلطه برفق واترك المحاليل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. انقل المرحلة العلوية الغنية بالخلايا البيض بعناية إلى أنابيب مخروطية نظيفة سعة 50 مليلتر ، واستخدم PBS معقمة لملء الأنبوب إلى الأعلى.

ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 400 مرة G لمدة عشر دقائق واستخدم 15 مل من PBS المعقم لإعادة تعليق الحبيبات. كرر خطوة الغسيل هذه مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بإعداد خمس تدرجات بيركول من 85 و 80 و 75 و 70 و 65 بالمائة في أنابيب مخروطية سعة 215 مليلتر وطبقة ملليلترين من تعليق الكريات البيض فوق كل تدرج.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتدرجات عند 800 مرة G لمدة 30 دقيقة مع الانقطاع. بعد الطرد المركزي ، اجمع الخلايا في الطبقات عند واجهات 75-80٪ و 70-75٪. استخدم PBS لغسل الخلايا مرتين ، ثم استخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا.

لقياس حركية إطلاق الحمض النووي خارج الخلية ، قم بإعداد تعليق للعدلات في وسط الفحص بتركيز اثنين في عشرة إلى ست خلايا لكل مليلتر. أضف خمسة ميكرومول لكل لتر من برتقالة SYTOX ، وهي صبغة ربط الحمض النووي غير المنفذة للغشاء واخلطها برفق. Aliquot العدلات البشرية في صفائح دقيقة سوداء شفافة معقمة مكونة من 96 بئرا لضمان أن وسط الفحص يغطي قاع البئر بالكامل.

إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضغط برفق على اللوحة الموجودة على الجانب. سخني الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في غضون ذلك ، استخدم وسيط فحص 37 درجة مئوية لإعداد محاليل تحتوي على محفزات بضعف تركيزاتها النهائية لاستخدامها.

كعنصر تحكم إيجابي في NET ، قم بإعداد 100 نانومولار فوربول ميريستات أسيتات ، أو PMA ، لعلاج العدلات البشرية لمدة أربع ساعات لتحفيز أقصى إطلاق NET. بعد ذلك ، قم بإعداد مقياس الفلور الدقيق للقياس. تحفيز العدلات عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من محلول التحفيز إلى 50 ميكرولترا من معلقات العدلات.

أضف تركيزا نهائيا قدره 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من الصابونين إلى بئر واحد ، لقياس إشارة إطلاق الحمض النووي القصوى. ضع اللوحة في القارئ وقم بقياس التغيرات في التألق على فترات دقيقتين لمدة أربع ساعات دون اهتزاز. لتحليل البيانات ، احسب الزيادات الطبيعية في التألق بمرور الوقت عن طريق طرح مضان خط الأساس من قيم نقطة النهاية لجميع الآبار بما في ذلك الصابونين.

يجب أن يكون الارتفاع في تألق الصابونين هو أعلى إشارة ويشار إليه باسم الحد الأقصى لإطلاق الحمض النووي. متوسط نتائج التكرارات وتقديمها كنسبة مئوية من الحد الأقصى لإطلاق الحمض النووي. لقياس تكوين NET باستخدام فحوصات MPO-DNA و HNE-DNA ELISA ، أضف الأجسام المضادة المضادة ل MPO أو المضادة ل HNE إلى ألواح ELISA ذات سعة الارتباط العالية ذات 96 بئرا ، واحتضنها طوال الليل لتغطيتها.

في صباح اليوم التالي ، استخدم 200 ميكرولتر لكل بئر من PBS لغسل ألواح ELISA ثلاث مرات. ثم استخدم 200 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار بنسبة 5٪ ، أو BSA ، و 0.1٪ ألبومين مصل بشري ، أو HSA ، لسد الآبار في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. في غضون ذلك ، تعمل عدلات البذور في 100 ميكرولتر من وسط الفحص على صفيحة مكونة من 96 بئرا بكثافة 100،000 خلية لكل بئر وتحفز تكوين NET بعد إضافة المحفزات عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

بعد ذلك ، قم بإجراء هضم DNase محدود عن طريق إضافة وحدتين لكل مليلتر من الحمض النووي إلى المواد الطافية للعدلات ثم تخلط جيدا وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أوقف التفاعل بإضافة 15 ميكرولتر من 25 مللي مولار EGTA واخلطه جيدا. اجمع المواد الطافية ونظف أنابيب الطرد الدقيق وقم بتدوير العينات للتخلص من بقايا الخلايا عند 300 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

جمع NETs دون هضم محدود إلى بيانات غير متسقة. تعد خطوة هضم الحمض النووي المحدودة أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج قابلة للتكرار. لذلك ، تم تحسين تركيز إنزيم DNase I وطول الهضم.

انقل المادة الطافية لتنظيف أنابيب الطرد الدقيق واحتفظ بها على الجليد. بعد ذلك ، باستخدام حصة من معيار NET المعد مسبقا ، قم بإعداد تخفيف واحد إلى اثنين في PBS و EGTA. الآن ، استخدم PBS مع EGTA لتخفيف عينات DNase التي قمت بهضمها عشرين ضعفا ونقلها على ألواح ELISA المغلفة بالأجسام المضادة الملتقطة.

احتضان الصفائح طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قبل استخدام PBS لغسل الألواح ثلاث مرات ، ضع 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الأجسام المضادة للكشف مثل الفجل الحار بيروكسيداز الأجسام المضادة للحمض النووي المترافق ، واحتضانه في الظلام لمدة ساعة واحدة. بعد أربع غسلات باستخدام PBS ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من ركيزة بيروكسيداز TMB ، واحتضن لمدة 30 دقيقة.

اللون الأزرق إلى نشاط البيروكسيداز ووجود NETs. لإيقاف التفاعل ، أضف 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المولي الواحد. سوف تتحول المحاليل الزرقاء إلى اللون الأصفر.

باستخدام مقياس ضوئي دقيق ، اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر. لمقارنة كمية مجمعات MPO-DNA أو HNE-DNA المقاسة مقارنة بمعيار NET ، اطرح الكثافة المثلى للخلفية من جميع العينات وارسم قيم امتصاص العينات القياسية المخففة مقابل محتواها النسبي من NET. باستخدام النطاق غير المشبع لهذا المنحنى القياسي ، قم بإنشاء خط اتجاه باستخدام أفضل ملاءمة أسية من البرنامج المستخدم.

أدخل قيم OD المقاسة للمجهول في معادلة خط الاتجاه التي ستعطي كمية NETs في العينة غير المعروفة كنسبة مئوية من معيار NET. أخيرا ، احسب متوسطات التكرارات وقدم البيانات النهائية ككمية مجمعات MPO-DNA أو HNE-DNA. تظهر هنا بيانات تمثيلية من مقايسة إطلاق الحمض النووي القائمة على التألق للعدلات البشرية التي تركت دون تحفيز أو تنشيطها باستخدام PMA أو P-aeruginosa.

P-aeruginosa إلى تكوين NET في PMNs البشرية. يوضح هذا الرسم البياني أن متوسطات الزيادة في تألق الآبار المكررة يتم حسابها وتطبيعها على أقصى قدر من التألق ويتم التعبير عنها كإطلاق للحمض النووي. تمثل صور التألق هذه العدلات التي تركت دون معالجة أو تحفيزها باستخدام PMA.

تظهر هنا صور التألق المناعي للعدلات البشرية المنشطة غير المحفزة و PMA و PA01 من مقايسة MPO-DNA و HNE-DNA Elisa. يظهر الحمض النووي خارج الخلية مورفولوجيا NET النموذجية ويتموضع مع MPO و histone H4 الرقيق ، وهي علامة على تكوين NET. تظهر هذه التجربة إطلاق MPO-DNA و HNE-DNA في العدلات البشرية باستخدام نفس المقياس.

معيار NET في المتوسط على 19.5 ميكروغرام لكل مليلتر من الحمض النووي خارج الخلية ، و 399 نانوغرام لكل مليلتر من MPO ، و 103.4 نانوغرام لكل مليلتر من HNE. استنادا إلى الأوزان الجزيئية ل MPO و HNE ، وأن ميكروغرام واحد من الحمض النووي يحتوي على 9.91 في 10 إلى 14 نيوكليوتيدات ، يحتوي معيار NET على 109 جزيئات HNE و 147 جزيئات MPO لكل 1 ، 000 نيوكليوتيدات. أخيرا ، تكشف تجربتان للتخفيف التسلسلي لمعيار NET أن النطاقات الديناميكية لكل من فحوصات MPO-DNA و HNE-DNA ELISA تتراوح بين 19 و 609 نانوجرام لكل مليلتر من الحمض النووي.

بمجرد إتقانها ، يمكن تجميع حمض SYTOX البرتقالي بسهولة وسرعة في ساعة واحدة ، مما يؤدي إلى نتائج في اليوم التالي. من السهل أيضا إجراء الاختبار الكمي NET وسينتج عنه بيانات في اليوم التالي إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد كمية الناتورالاز في العدلات البشرية بطريقة عالية الإنتاجية.