طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور نشاط إنزيمات إزالة اليوبيكويتين في الخلايا. ويتم تحقيق ذلك من خلال زراعة الخلايا حتى تصل إلى درجة عالية من التلاقي، ثم حصادها لتسهيل إنتاج مستخلص مركّز في خطوة ثانية. ويُستخدم التحلل الميكانيكي اللطيف لإنتاج مستخلص يحافظ على الصورة الأيضية لسيتوبلازم الخلية.

بعد ذلك، يتم تحضين الإنزيمات مع مجسات مشتقة من الهيماجلوتينين بهدف وسم إنزيمات نزع اليوبيكويتين (de ubiquitin enzymes) عن طريق التفاعل مع ثمالة السيستين في الموقع النشط، وتظهر النتائج ملفات النشاط للعديد من إنزيمات نزع اليوبيكويتين بناءً على لطخة ويسترن (Western blotting) والكشف الكيميائي الضوئي اللاحق. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل لطخة ويسترن العادية في أنها تسمح للمستخدم بتصور أنشطة إنزيمات متعددة. في تجربة واحدة، قم بتحضير أوساط زراعة الخلايا عن طريق سحب 30 milliliters من وسط DMEM المعدل (DMEM) مضافاً إليه 10% fetal bovine serum ووضعها في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter للزراعة.

لنقل الخلايا المستخدمة في التجربة، انقُل خلايا M 17 أو he A المجمدة من تخزين النيتروجين السائل إلى بيكر صغير يحتوي على ماء فاتر. بعد ذلك، انقُل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter يحتوي على 30 milliliters من الوسط الغذائي. بعد ذلك، أضف بعضاً من الوسط الغذائي إلى قارورة الخلايا وانقُل الخلايا المعاد تعليقها خلال خمس ثوانٍ من عملية الإذابة.

قم بطرد معلق الخلايا مركزياً عند 450 Gs لمدة خمس دقائق للحصول على كريسالة خلوية. ثم أضف 20 milliliters من الوسط الغذائي في دورق T 75. قم بإزالة الوسط الغذائي من الخلايا باستخدام الشفط.

أضف خمسة مللي لتر (5 mL) من الوسط الغذائي الطازج إلى كتلة الخلايا المترسبة وقم بإعادة تعليقها. انقل الخمسة مللي لتر (5 mL) من معلق الخلايا إلى 20 مللي لتر (20 mL) من الوسط الغذائي في دورق T 75 واحضنها عند 37 °C. يتم تغيير الوسط الغذائي كل ثلاثة أيام حتى يتم حصاد الخلايا.

قم بإزالة الوسط الغذائي عن طريق الشفط، مع الحرص على عدم لمس الخلايا. اغسل الخلايا باستخدام خمسة milliliters من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات أو PBS. ثم قم بإزالة PBS باستخدام الشفط.

بعد ذلك، أضف ثلاثة مليلتر من tripsin EDTA إلى قارورة T 75 واتركها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. وبعد انتهاء فترة الحضن، أضف ستة مليلتر من الوسط الغذائي الطازج إلى القارورة وأعد تعليق الخلايا.

انقل المعلق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter وقم بالطرد المركزي عند 290 Gs لمدة خمس دقائق، ثم تخلص من السائل الطافي وأضف خمسة milliliters من PBS. انقر بلطف على قاع الأنبوب لتفتيت الراسب قبل إجراء الطرد المركزي عند 290 Gs لمدة خمس دقائق. بعد تكرار الغسل بـ PBS ثلاث مرات، قم بإزالة PBS القديم وأعد تعليق الخلايا في 1 milliliter من PBS طازج.

بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب إبيدور وقم بالطرد المركزي بسرعة 290 GS لمدة خمس دقائق. ولإجراء تحلل الخلايا، قم بقياس الحجم التقريبي للراسب باستخدام الماصة، ثم زن خرزات زجاجية بنسبة كتلة إلى حجم تبلغ واحد إلى واحد. أضف محلول التحلل إلى الراسب بضعف حجم الراسب.

بعد ذلك، أضف الخرز الزجاجي إلى الراسب ومحلول التحلل. قم بتحليل الخلايا في أنبوب einor عند أقصى درجة تقليب لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C عن طريق الرج الميكانيكي (vortexing) في غرفة باردة. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة عند 200 GS لمدة 30 ثانية.

لترسيب الخرزات وجمع السائل الطافي. أضف نفس حجم الخرزات الزجاجية المستخدم سابقاً إلى السائل الطافي، ثم استخدم جهاز الفورتكس مرة أخرى بأقصى درجة تقليب لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، بعد إجراء عملية طرد مركزي قصيرة عند 200 Gs لمدة 30 ثانية. ولترسيب الخرزات الزجاجية، يتم جمع السائل الطافي.

أخيراً، يتم إجراء الطرد المركزي عند 5,030 GS لمدة خمس دقائق. ولإزالة النوى والأغشية والخلايا غير المتكسرة، يتم جمع الراشح، والذي يمثل محلل الخلايا المستخدم في اشتقاق الأنسجة، الذي يتم بواسطة حمض السينيك أو تحليل BCA. وفي طبق يحتوي على 96 بئراً، يتم تحديد تركيز البروتين في المحلل باستخدام قارئ أطباق 96 بئراً قياس اللون كما هو محدد في بروتوكول مجموعة تحليل بروتين BCA.

بعد تحديد تركيز البروتين، قم بتكملة حجم عينة تعادل 20 micrograms من البروتين الكلي لتصل إلى 50 microliters باستخدام الماء منزوع الأيونات. ثم أضف 2 microliters من HAUB vinyl cell phone بتركيز 1.35 micromolar إلى المحلول. وتكون النتيجة 20 micrograms من المستخلص الخلوي إلى 50 nano molar من المسبار في خليط التفاعل النهائي.

يكون هذا بزيادة مولارية كبيرة. ولضمان وسم إنزيمات إزالة اليوبيكويتين الوظيفية أو الـ dubs، يُترك المحلول للتحضين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، يُضاف منظم عينات laly إلى المحلول.

لحجم تفاعل يبلغ 52 µL، استخدم 26 µL من محلول عازل للعينة بتركيز 2x، أو 13 µL من محلول عازل للعينة بتركيز 4x، أو 8.87 µL من محلول عازل للعينة بتركيز 6x. يتم تحضين العينة لمدة خمس دقائق عند 95 °C، ثم تُبرد على الثلج.

قبل تحميل الهلام لإجراء تحليل لطخة ويسترن، قم أولاً بتحميل هلام tris glycine بتركيز 40% إلى 20% وبـ 12 بئراً بـ 40 µL من العينة المحضرة. قم بتشغيل الهلام عند 95 volts حتى تصل جبهة الأيونات إلى القاع. بعد ذلك، قم بإجراء عملية نقل للهلام على غشاء poly vine DI fluoride أو PVDF طوال الليل وفقاً لما يلي.

أولاً، يتم تحضين الغشاء في صبغة AMDO السوداء ومسحه ضوئياً للحصول على صورة توضح كمية البروتين في كل مسار. بعد ذلك، يتم غسل الغشاء وتحضينه في محلول 5% من الحليب في PBS لمدة ساعة واحدة لغرض الحجب. بعد ذلك، يتم تحضين الغشاء في الجسم المضاد الأولي anti HA بتركيز 1:10,000 في محلول 5% من الحليب في PBS، إما طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C أو لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضن، يتم إجراء ثلاث عمليات غسيل لمدة خمس دقائق لكل منها في محلول PBS مع منظف tween 20 بتركيز 0.1%. بعد ذلك، يتم حضن الغشاء في مضاد أجسام لـ mouse horseradish peroxidase بتركيز 1:10,000 في 5% milk في محلول PBS لمدة ساعتين على الأقل. تُجرى ثلاث عمليات غسيل كما سبق، تليها عملية غسيل واحدة لمدة خمس دقائق في محلول PBS.

أخيرًا، يتم تحضين الغشاء في كاشف كشف بالتلألؤ الكيميائي لمدة 10 دقائق، والكشف باستخدام كاشف لومينيسنتي. استخدم إعداد التعريض التلقائي في الكاشف. تم التحقق من تحميل البروتين باستخدام صبغة AM mito black.

تضمن خطوة الضبط هذه أن الاختلافات في النشاط تعود إلى عمليات خلوية فعلية وليس إلى عدم تساوٍ في تحميل البروتين. تشير الممرات الموضحة هنا إلى استخدام كميات متساوية من البروتين في التجربة الأولى. أما في التجربة الثانية، فقد تم تحميل كميات غير متساوية من البروتين بسبب الاختلافات المتوقعة في ملفات النشاط لمختلف الخطوط الخلوية.

تم القيام بذلك لضمان الكشف عن ملف النشاط لخلية M 17. حُضنت المستخلصات مع ethyl maide، وهو مثبط للسيستين ومن شأنه أن يؤدي إلى تقليل الإشارة في تحليل Western blot. ثم حُضنت الأغشية في جسم مضاد أولي مضاد لـ HA.

بريبيروكيسيداز الفجل الحصاني للفئران، ومن ثم الكشف عنها باستخدام التصوير بالتألق الكيميائي. يؤدي الوسم الناجح لإنزيمات dubs باستخدام المجسات إلى ظهور نمط في كل حارة من حارات الغشاء. وتتوافق شدة الحزم عند الأوزان الجزيئية المختلفة مع مستوى نشاط إنزيم dub.

تصبح الاختلافات في مستويات نشاط مختلف إنزيمات dubs عبر الخطوط الخلوية واضحة عند مقارنة بروتينات مماثلة مثل U CHL one في خلايا he a و M 17. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التجزيء الخلوي الفرعي للإجابة على تساؤلات مثل، كيف تؤثر العمليات المرضية على نشاط إنزيم اليوبيكويتين في العضيات المرتبطة بالغشاء؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس نشاط إنزيم إزالة اليوبيكويتين باستخدام مجسات موجهة للموقع النشط.