التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن يرقات سمك الزيبرا مجهرياً بممرض بكتيري من نوع streptococcus IEA لإجراء تصوير حي غير جراحي للاستجابة المناعية للعائل. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تعبئة إبرة الحقن المجهري بمعلق بكتيري ورص يرقات سمك الزيبرا المخدرة على قالب حقن من الأجاروز. بعد ذلك، يتم حقن المعلق البكتيري مجهرياً في الحويصلة الأذنية لليرقات.

بعد ذلك، يتم تثبيت اليرقات المحقونة في أغاروز منخفض الانصهار. وأخيراً، يتم وسم الخلايا المناعية للمضيف ضوئياً لتسهيل تتبعها، وتصوير العدوى باستخدام مجهر كونفوكال. وفي النهاية، يُستخدم الحقن المجهري لبكتيريا streptococcus IEA في الحويصلة الأذنية، وما يليه من وسم ضوئي ومجهرية كونفوكال لدراسة الاستجابة المناعية للمضيف في يرقات zebrafish.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الحقن في الوريد الذيلي في أن الحقن في الحويصلة الأذنية يولد عدوى بكتيرية موضعية تسمح بالتصوير غير الجراحي للتفاعلات بين المضيف والممرض في يرقات zebrafish الشفافة. للبدء، قم بتحضير محلول agar بنسبة 1.5 إلى 2% عالي الانصهار في وسط E3، وسخنه في الميكروويف حتى يصبح المحلول شفافاً. وبمجرد أن يبرد، صب بعضاً من الـ agar في طبق Petri، مع إضافة كمية كافية فقط لتغطية قاع الطبق ثم قم بتدويره.

بمجرد أن يتصلب الـ aros، ضع مشط هلام (gel comb) مغسولاً ومجففاً في الأعلى بحيث يستقر الطرف الصلب على سطح طبق بتري، بينما يلامس الطرف المسنن طبقة الـ aros. تأكد من أن المشط في وضع أفقي قدر الإمكان، بحيث يشكل زاوية قدرها 30 درجة بالنسبة لطبقة الـ aros السفلية. صب كمية صغيرة إضافية من الـ aros عند الواجهة الفاصلة بين المشط وطبقة الـ aros السفلية بحيث تغطي طبقة الـ aros الجديدة آبار المشط.

اتركه ليبرد تماماً قبل إزالة المشط. بعد ذلك، وباستخدام طرف ماصة، قم بإزالة أي قطع زائدة من الـ aros من الآبار. صب وسط E three فوق قالب الحقن واحفظه في درجة حرارة أربعة درجات Celsius.

بعد تحضير اللقاح من خلايا SNEA ويرقات سمك الزيبرا للحقن وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتشغيل الحاقن الدقيق واضبط نطاق الوقت على الميلي ثانية. افتح الصمام الموجود في خزان ثاني أكسيد الكربون للسماح للغاز بالتدفق في الخط. يجب أن تقرأ قيمة الضغط في الحاقن الدقيق 20 PSI تقريباً، ثم قم بعمل مزج دوامي (vortex) لمزرعة SNEA المحضرة في الفينول الأحمر وPBS، واستخدم طرف شاحن دقيق لتحميل 2 إلى 3 µL من المزرعة في إبرة حقن شعيرية مسحوبة. قم بتركيب الإبرة المحملة على مناول دقيق متصل بحامل مغناطيسي، وضعها تحت مجهر ستيريو بحيث تكون الإبرة بزاوية تتراوح بين 45 إلى 65 درجة تقريباً بالنسبة لقاعدة المجهر.

أولاً، قم بكسر طرف الإبرة باستخدام ملقط دقيق، ثم اضغط على دواسة الحقن الدقيق لإخراج قطرة من اللقاح على طرف الإبرة. استخدم شريط المقياس الموجود في العدسة العينية للمجهر لقياس قطر القطرة. يجب أن يكون قطر القطرة حوالي 0.10 millimeter، وهو ما يعادل نانولتر واحد تقريباً من حيث الحجم.

لضبط حجم القطرة، قم بتعديل إعداد المدة في المحقن الدقيق أو استخدم ملاقط دقيقة لقص جزء أكبر من طرف الإبرة. يجب أن يكون وقت الحقن بين 20 و35 milliseconds لتجنب إلحاق ضرر كبير بالأنسجة. بعد ذلك، وباستخدام ماصة نقل بلاستيكية، انقل سمكة واحدة لكل بئر إلى كل من الآبار الـ 12 في قالب الحقن.

بعد ذلك، وباستخدام قضيب زجاجي، أو حلقة شعر، أو طرف بلاستيكي، قم بتوجيه اليرقات برفق بحيث تكون الرؤوس موجهة نحو الجزء الخلفي من المجهر، وأكياس المح الصناعية ملاصقة للجانب الأيسر من البئر. وجه الأذن اليسرى لليرقات للأعلى باتجاه السقف. وعندما تصبح اليرقات جاهزة للحقن، استخدم مقابض الميكرو-مانيبوليتور (micro manipulator) لمحاذاة الإبرة المحملة مع الحويصلة الأذنية بحيث يكون كلاهما في نفس مجال الرؤية.

باستخدام طرف الإبرة، قم بثقب الطبقة الطلائية الخارجية للحويصلة الأذنية بحيث يكون الطرف داخل الحويصلة مباشرة. الآن، وباستخدام ضغط منخفض بما يكفي لتجنب تمزق التجويف، اضغط على دواسة القدم لحقن 1 nanoliter من الجرعة المطلوبة من SNEA. إذا نجحت عملية الحقن، يجب أن تمتلئ الحويصلة الأذنية، وليس الأنسجة المحيطة، بلقاح الفينول الأحمر.

اسحب الإبرة بعناية من اليرقات، وتحت تكبير 5x، حرك لوحة الحقن يدويًا بحيث تكون اليرقة في مجال الرؤية. في حالة حقن بكتيريا موسومة فلوروسنتياً تحت مجهر فلوروسنتي، افحص اليرقات المحقونة بصرياً واحتفظ فقط بتلك التي حدث فيها ترسيب البكتيريا داخل الحويصلة الأذنية حصراً، وذلك لضمان بقاء حجم الحقن ثابتاً طوال فترة التجربة. بعد حقن كل جنين ترتيبه 48، احقن قطرة من المعلق البكتيري في أنبوب طرد مركزي سعة 1.7 milliliter يحتوي على 100 microliters من PBS المعقم.

ثم يتم توزيع 100 µL على أطباق THY مضافاً إليها P auger، وتحضن عند 37 °C طوال الليل. ولتحديد CFU في حجم الحقن، عند الانتهاء من حقن مجموعة كاملة مكونة من 12 يرقات على منصة الحقن، تُزال اليرقات بعناية من الآبار باستخدام ماصة نقل بلاستيكية وتوضع في طبق بتري جديد. ثم يتم إزالة محلول trica واستبداله بنحو 2 mL من وسط E three الطازج للسماح لليرقات بالتعافي.

قم بحضن الأجنة وفقاً للبروتوكول المكتوب. بعد تحضير الـ aros باستخدام الـ trica، ووفقاً للبروتوكول المكتوب على منصة المجهر الستيريو، استخدم ماصة نقل لوضع أربع إلى خمس يرقات مخدرة في طبق ذي قاع زجاجي. قم بإزالة محلول trica و aro من حمام مائي بدرجة حرارة 55 °C واتركه ليبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة إلى دقيقتين.

في هذه الأثناء، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من اليرقات المخدرة. بعد ذلك، صب الأجار المبرد في الطبق حتى يتم تغطية حوالي نصف السطح. ثم قم بتدوير الطبق لتوزيع الأجار.

التقط اليرقات التي طفت إلى جوانب الطبق وأعد نقلها بالماصة إلى المركز. بعد ذلك، وباستخدام المجهر الستيريوسكوبي، استعمل طرف ماصة طويل لتحديد وضعية اليرقات بلطف كما هو مطلوب للتصوير. وبالنسبة لوضعية الحويصلة الأذنية، قم بوضع اليرقات بحيث تكون الحويصلة الأذنية اليمنى متجهة للأعلى والحويصلة الأذنية اليسرى مسطحة مقابل قاع الطبق.

اترك الـ aros تبرد لمدة 10 دقائق تقريباً قبل تحريك الطبق. ثم أضف بلطف باستخدام الماصة بعضاً من محلول trica و E three فوق طبقة الـ aros للحفاظ على رطوبتها. ولتصوير العينات، استخدم جهاز Zack scan مع ليزر 488 nanometer و 543 nanometer.

استخدم المسح الخطي المستمر لضبط قدرة الليزر وكسب الكاشف. تحقق من عدم وجود فلورة حمراء محولة ضوئياً عن طريق الخطأ في نافذة التحكم في الحصول على الصور. من إعدادات التحفيز، اختر أداة استخدام الماسح الضوئي (use scanner tool) ثم اختر الرئيسية (main)، وحدد ليزر 405 nanometer واضبط قدرته على 70%.

ثم باستخدام خيار الدائرة، حدد المنطقة المستهدفة في الحويصلة الأودية (odic vesicle)، وتحت إعداد بدء التحفيز، اختر "التنشيط" (activation) مع تفعيل مرحلة ما قبل التنشيط بإطار واحد ووقت تنشيط قدره 60,000 milliseconds في نافذة إعدادات الاستحواذ. وتحت عنوان المسح الزمني، اختر فترتين مدة كل منهما دقيقة واحدة، واحدة لما قبل التحويل الضوئي وأخرى لما بعده. ابدأ سلسلة التصوير المتقطع (time-lapse) لبدء التحويل الضوئي للمنطقة المستهدفة المحددة.

أخيراً، قم بمسح العينة باستخدام جهاز Zack وليزر 488 و543 nanometer. لتصور الفلورة الحمراء المحولة ضوئياً، بالإضافة إلى أي فلورة خضراء متبقية، فإن الحقن المجهري لـ SNEA في phenol red داخل الحويصلة الأذنية يؤدي إلى استجابة مضيف موضعية في البداية، والتي عند الحقن بشكل صحيح يجب أن تظهر فقط في الحويصلة الأذنية وليس في الأنسجة المحيطة أو الدم. بدلاً من ذلك، في حال حقن بكتيريا موسومة، يمكن لمسح سريع لليرقات المصابة فور الحقن التأكد من وجود البكتيريا في الحويصلة الأذنية فقط وليس في الأنسجة المحيطة.

تعد مواقع الحقن المجهري للعدوى الموضعية الأولية مفيدة لدراسة الجذب الكيميائي للكريات البيضاء كما هو موضح هنا. ويمكن قياس تجنيد الكريات البيضاء إما عن طريق صبغ حبيبات الخلايا المتعادلة بصبغة سودان الأسود، أو بتثبيت الخطوط المعدلة وراثياً الفلورية باستخدام خطوط zebrafish المعدلة وراثياً والتي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر. وقد كشف Dendra two، وتحديداً في الخلايا البلعمية أو الخلايا المتعادلة، أن حقن NEA في الحويصلة الأذنية أدى إلى تحفيز تجنيد الخلايا المتعادلة والخلايا البلعمية والبلعمة البكتيرية خلال 60 دقيقة بعد العدوى.

في هذا الشكل، تم تحويل الخلايا البلعمية المسمى بـ DRA والعدد 2 منها، والتي تم استدعاؤها إلى الحويصلة الأذنية بعد خمس ساعات من العدوى، ضوئياً ثم تتبعها على مدار الـ 24 ساعة التالية. وعلى الرغم من بقاء بعض الخلايا المحولة ضوئياً في الحويصلة الأذنية أو منطقة الرأس، فقد وُجد بعضها أيضاً منتشرًا في جميع أنحاء جسم اليرقات كما هو موضح هنا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الحقن المجهري لبكتيريا streptococcus n EEA في الحويصلة الأذنية لأسماك الزيبرفيش في عمر ثلاثة أيام بعد الإخصاب.

ويتضمن ذلك أولاً صف اليرقات المخدرة على قالب الحقن وتعبئة الإبرة باللقاح البكتيري. ثانياً، حقن البكتيريا مجهرياً في الحويصلة الأذنية. ثالثاً، تثبيت اليرقات المصابة في هلام الآجار منخفض الانصهار، ورابعاً، استخدام المجهر البؤري لوسم كريات الدم البيضاء لدى المضيف ضوئياً وتصوير التفاعلات بين كريات الدم البيضاء ومسببات الأمراض في الجسم الحي.