التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات العقدية iniae العدوى

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحقن الدقيق ليرقة الزرد مع المكورات العقدية البكتيرية الممرضة IEA للتصوير الحي غير الجراحي للاستجابة المناعية للمضيف. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل إبرة الحقن المجهري أولا بتعليق بكتيري واصطفاف يرقات الزرد المخدرة على قالب حقن الاغاروز. بعد ذلك ، يتم حقن المعلق البكتيري بشكل دقيق في الحويصلة الأذنية لليرقات.

ثم يتم تركيب اليرقة المحقونة في الاغاروز منخفض الذوبان. أخيرا ، يتم تصنيف الخلايا المناعية المضيفة ل Gus لسهولة التتبع ويتم تصوير العدوى باستخدام مجهر متحد البؤر. في نهاية المطاف ، يتم استخدام الحقن الدقيق للمكورات العقدية IEA في الحويصلة الأذنية ووضع العلامات اللاحقة على الصور والفحص المجهري متحد البؤر لدراسة الاستجابة المناعية للمضيف ليرقات الزرد.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل حقن الوريد الزرد ، هي أن حقن الحويصلة الأذنية يولد عدوى بكتيرية موضعية للسماح بالتصوير غير الجراحي لتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة في يرقة الزرد الشفافة. للبدء ، قم بإعداد محلول aro ذوبان عالي بنسبة 1.5 إلى 2٪ في E ثلاثة متوسطة وميكروويف حتى يصبح المحلول صافيا. بمجرد أن يبرد ، اسكب بعضا من الحبيبات في طبق بتري ، مع إضافة ما يكفي لتغطية قاع الطبق ولفه.

بمجرد أن يتجمد الأروس ، ضع مشطا جليا مغسولا ومجففا في الأعلى بحيث يستقر الطرف الصلب على الجزء العلوي من طبق بتري وتلامس النهاية المسننة الأروس. تأكد من أن المشط أفقي قدر الإمكان ، مما يخلق زاوية 30 درجة فيما يتعلق بطبقة aros السفلية. صب كمية صغيرة إضافية من aros في الواجهة بين المشط وطبقة aros السفلية بحيث تغطي طبقة aros الطازجة آبار المشط.

اتركه ليبرد تماما قبل إزالة المشط. ثم باستخدام طرف الماصة ، قم بإزالة أي قطع متدلية من الآبار من الآبار. صب E ثلاثة متوسطة فوق قالب الحقن وتخزينها على أربع درجات مئوية.

بعد تحضير لقاح SNEA ويرقات الزرد للحقن وفقا لبروتوكول النص ، قم بتشغيل الحاقن الصغير واضبط النطاق الزمني على مللي ثانية. افتح الصمام الموجود على خزان ثاني أكسيد الكربون للسماح للغاز بالدخول إلى الخط. يجب أن يقرأ ضغط الحاقن الصغير ما يقرب من 20 رطل لكل بوصة مربعة ، ودوامة SNEA المحضرة باللون الأحمر الفينول و PBS ، واستخدام طرف اللودر الصغير لتحميل اثنين إلى ثلاثة ميكرولتر من المزرعة في إبرة حقن شعرية مسحوبة ، وتركيب الإبرة المحملة على مناور دقيق متصل بحامل مغناطيسي ووضعه تحت مجهر استريو بحيث تكون الإبرة بزاوية 45 إلى 65 درجة تقريبا فيما يتعلق بقاعدة المجهر.

قم أولا بقطع طرف الإبرة باستخدام زوج من الملقط الدقيق ، واضغط على دواسة القدم للحاقن الصغير لتوزيع قطرة من اللقاح على طرف الإبرة. استخدم شريط المقياس في عدسة العين بالمجهر لقياس قطر القطرة. يجب أن يكون قطر القطرة حوالي 0.10 ملم ، أي حوالي نانولتر واحد في الحجم.

لضبط حجم القطرة ، اضبط إعداد المدة على الحاقن الصغير أو استخدم ملاقط دقيقة لقص المزيد من طرف الإبرة. يجب أن يتراوح وقت الحقن بين 20 و 35 مللي ثانية لتجنب الكثير من تلف الأنسجة. بعد ذلك ، باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، انقل سمكة واحدة لكل بئر إلى كل بئر من 12 بئرا في قالب الحقن.

ثم باستخدام قضيب زجاجي أو حلقة شعر أو طرف بلاستيكي ، ضع اليرقات برفق بحيث يتم توجيه الرؤوس نحو الجزء الخلفي من المجهر وتكون أكياس الصفار على الجانب الأيسر من البئر. وجه الأذن اليسرى لليرقات نحو السقف. عندما تكون اليرقات جاهزة للحقن ، استخدم المقابض الموجودة على المعالج الدقيق لمحاذاة الإبرة المحملة مع الحويصلة الأذنية بحيث يكون كلاهما في نفس مجال الرؤية.

باستخدام طرف الإبرة ، اخترق الطبقة الظهارية الخارجية للحويصلة الأذنية بحيث يكون الطرف داخل الحويصلة مباشرة. الآن باستخدام ضغط منخفض بما يكفي حتى لا يتمزق التجويف ، اضغط على دواسة القدم لحقن نانولتر واحد من الجرعة المطلوبة من SNEA. إذا نجح الحقن ، يجب أن تمتلئ الحويصلة الأذنية ، ولكن ليس الأنسجة المحيطة بلقاح أحمر الفينول.

اسحب الإبرة بعناية من اليرقات وتحت تكبير خمسة × ، حرك لوحة الحقن يدويا بحيث تكون اليرقات في الأفق. في حالة حقن البكتيريا المصنفة بالفلورسنت تحت المجهر الفلوري ، فقم بمسح اليرقات المحقونة بصريا واحتفظ فقط بتلك التي حدث فيها ترسب البكتيريا فقط داخل الحويصلة الأذنية لضمان بقاء حجم الحقن كما هو على مدار التجربة. بعد حقن كل جنين 48 ، قم بحقن قطرة من المعلق البكتيري في أنبوب طرد مركزي سعة 1.7 مليلتر يحتوي على 100 ميكرولتر من PBS المعقم.

ثم قم بوضع 100 ميكرولتر على ألواح مثقاب THY plus P ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. لتحديد CFU في حجم الحقن ، عندما يتم حقن مجموعة كاملة من 12 يرقة على منحدر الحقن ، استخدم بعناية ماصة نقل بلاستيكية لإزالة اليرقات من الآبار ووضعها في طبق بتري جديد. قم بإزالة محلول trica واستبدله بحوالي ملليلترين من E ثلاثة متوسطة طازجة للسماح لليرقات بالتعافي.

احتضان الأجنة وفقا لبروتوكول النص. بعد تحضير aros مع trica ، وفقا لبروتوكول النص على مرحلة المجهر الاستريو ، استخدم ماصة نقل لوضع أربعة إلى خمس يرقات مخدرة في طبق زجاجي القاع. قم بإزالة محلول التريكا وآرو من الحمام المائي بدرجة حرارة 55 درجة مئوية واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة إلى دقيقتين.

في غضون ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من اليرقات المخدرة. بعد ذلك ، اسكب agros المبرد في الطبق حتى يتم تغطية حوالي نصف السطح. ثم حرك الطبق لنشر الحبوب.

التقط اليرقات التي تطفو على جوانب الطبق وأعدها إلى المنتصف. ثم تحت المجهر المجسم، استخدم طرف ماصة طويل لوضع اليرقات برفق حسب الرغبة للتصوير. تضع الحويصلة الأذنية اليرقات بحيث تكون الحويصلة الأذنية اليمنى متجهة لأعلى وتكون الحويصلة الأذنية اليسرى مسطحة مقابل قاع الطبق.

دع الحروس يبرد لمدة 10 دقائق قبل تحريك الطبق. ثم قم بتقطيع بعض محلول التريكا و E الثلاثة برفق فوق طبقة الأروس للحفاظ على رطوبتها. لتصور العينات ، استخدم مسح Zack باستخدام ليزر 488 نانومتر و 543 نانومتر.

استخدم مسح الخط المستمر لضبط طاقة الليزر وكسب الكاشف. تحقق من عدم وجود تألق أحمر محول عن طريق الخطأ في نافذة التحكم في الحصول على الصورة. ضمن إعداد التحفيز ، حدد أداة استخدام الماسح الضوئي واختر رئيسي ، وحدد ليزر 405 نانومتر واضبطه على طاقة 70٪.

ثم باستخدام خيار الدائرة ، حدد منطقة الاهتمام في الحويصلة odic تحت إعداد بدء التحفيز ، وحدد التنشيط في سلسلة مع تنشيط مسبق لإطار واحد ووقت تنشيط يبلغ 60 ، 000 مللي ثانية في نافذة إعداد الاستحواذ. تحت عنوان المسح الزمني ، اختر فترتين مدتهما دقيقة واحدة لكل منهما ، واحدة لتحويل ما قبل والأخرى لتحويل الصورة اللاحقة. ابدأ سلسلة اللقطات المتتابعة لبدء تحويل الصور لمنطقة الاهتمام المحددة.

أخيرا ، قم بمسح العينة باستخدام Zack والليزر 488 و 543 نانومتر. لتصور الصورة ، فإن التألق الأحمر المحول ، بالإضافة إلى أي حقن دقيق مضان أخضر متبقي من SNEA باللون الأحمر الفينول في الحويصلة الأذنية ينتج عنه استجابة مضيف موضعية في البداية والتي عند حقنها بشكل صحيح يجب رؤيتها فقط في الحويصلة الأذنية وليس في الأنسجة المحيطة أو الدم. بدلا من ذلك ، إذا تم حقن البكتيريا المصنفة ، فإن الفحص السريع لليرقات المصابة مباشرة بعد الحقن يمكن أن يؤكد أن البكتيريا موجودة فقط في البكتيريا في الأذن وليس في الأنسجة المحيطة.

تعد مواقع الحقن المجهري للعدوى الموضعية في البداية مفيدة لدراسة الانجذاب الكيميائي للكريات البيض كما هو موضح هنا. يمكن قياس تجنيد الكريات البيض عن طريق السودان ، أو التلوين الأسود لحبيبات العدلات أو تثبيت الفورمالديهايد للخطوط المعدلة وراثيا الفلورية باستخدام خطوط سمك الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر. كشف Dendra two ، وتحديدا في الضامة أو العدلات ، أن حقن NEA في الحويصلة الأذنية أدى إلى تجنيد العدلات والضامة والبلعمة للبكتيريا في غضون 60 دقيقة بعد الإصابة.

في هذا الشكل ، تم تحويل DRA اثنين من البلاعم المسماة التي تم تجنيدها في الحويصلة الأذنية بعد خمس ساعات من الإصابة ثم تتبعها خلال ال 24 ساعة التالية. على الرغم من أن بعض الخلايا المحولة بالصور لا تزال في الحويصلة الأذنية أو منطقة الرأس ، فقد تم العثور على بعضها أيضا منتشرة في جميع أنحاء جسم اليرقات كما هو موضح هنا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحقن الدقيق للمكورات العقدية n المنطقة الاقتصادية الأوروبية في الحويصلة الأذنية لأسماك الزرد التي تتراوح أعمارها بعد ثلاثة أيام من الإخصاب.

يتضمن ذلك اصطفاف يرقات مخدرة واحدة على قالب الحقن وتحميل الإبرة باللقاح البكتيري. اثنان من البكتيريا الدقيقة التي تحقن في الحويصلة الأذنية. ثلاثة ، تركيب اليرقات المصابة في هواء منخفض الذوبان ، وأربعة ، باستخدام مجهر متحد البؤر لتسمية صور الكريات البيض المضيفة وتصوير تفاعلات مسببات الكريات البيض في الجسم الحي.