الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

الهدف العام من هذا الإجراء هو استنساخ والتعبير عن الأجسام المضادة التي تنتجها الخلايا البائية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا البائية من نسيج مصدر ذي صلة مثل الدم أو من الغدة الزعترية. والخطوة الثانية هي إجراء عملية الفرز الخلوي المنشط بالفلورة (FACS) واختيار مجتمع الخلايا البائية الإيجابية لإنتاج IgG.

بعد ذلك، يتم تخليد الخلايا عن طريق العدوى بفيروس Epstein-Barr بالتزامن مع تنشيط المستقبل الشبيه بالتول التاسع بواسطة C-P-G-O-D-N 2006 والحفاظ عليها في المزرعة. وتتمثل الخطوات النهائية في عزل RNA من النسائل التي ثبت إيجابيتها لإنتاج IgG بواسطة اختبار Eliza، وتوليد DNA مكمل من كل من سلاسل IgG الخفيفة والثقيلة. وفي النهاية، يمكن استنساخ تسلسلات IgG في نواقل تعبير ثديية لإنتاج كميات عالية من IgG البشري أحادي النسيلة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تقنية عرض الفاج (phage display) في عدم فقدان الاقتران الأصلي للسلاسل الثقيلة والخفيفة لـ IgG. ويمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال المناعة الذاتية، مثل اكتشاف الأجسام المضادة الذاتية الممرضة وتوصيفها وظيفياً. ولا تنسَ أن العمل مع مواد المرضى وفيروس EBV قد ينطوي على مخاطر.

يعد فيروس EB ممرضاً بشرياً، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة دائماً عند تنفيذ هذه الخطوات، مثل العمل في مختبرات بمستوى أمان حيوي ثانٍ (BSL-2) وارتداء معدات الوقاية المناسبة. قبل صبغ خلايا الـ PBMCs، يتم زرعها في دورق سعة 25 سنتيمتراً مع 6 ملليلتر من وسط RPMI 1640 الكامل، وتُترك لتتعافى طوال الليل. بعد حجب وغسل الخلايا، يتم جمع الـ PBMCs في أنبوب يحتوي على نصف ملليلتر من الوسط ثم يتم إجراء عملية الطرد المركزي لترسيبها. بعد ذلك، تُعاد معلقة الخلايا في محلول التوسيم ومن ثم يتم عدّها.

بعد ذلك، قم بتحضير أنبوبي FACS يحتوي كل منهما على 5 مليون خلية في 200 µL من المنظم في هذه الأنابيب. أضف 10 µL من anti CD 22 P-E-R-C-P أو 40 µL من anti IgG pe واتركها لتحضن لمدة 30 دقيقة على الثلج وفي الظلام، ثم اغسل الخلايا وقم بترشيحها وفرزها. الهدف هو عد الخلايا ذات الإيجابية المزدوجة.

ابدأ بتخفيف خلايا P BMCs المفروزة بمعدل خلية واحدة لكل microliter في وسط RPMI 1640، وهو وسط كامل مع إضافة C PG 2006 وEBV. بعد ذلك، وفي غطاء التدفق الصفحي، يتم استزراع 110 microliters من تخفيف الخلايا مع EBV وCPG 2006 في بئرين من طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً، والتي سبق استزراع خلايا WI 38 المشععة فيها. إن إصابة 50 خلية لكل بئر هي الحالة المثلى وتزيد من احتمالية الحصول على جسم مضاد أحادي النسيلة.

ومع ذلك، نوصي بتأكيد ذلك عن طريق PCR. بعد أسبوع من الحضن، افحص الخلايا تحت المجهر للتحقق من نمو الخلايا البائية (B-cell). بعد أسبوعين، قم بتغيير الوسط الغذائي؛ اسحب 90 µL من الوسط ببطء من كل بئر وانقلها إلى طبق جديد.

لاختبار إنتاج IgG بواسطة Eliza. ثم أضف 100 µL من الوسط المكمل الطازج، بما في ذلك IL2 إلى كل بئر. استمر في مراقبة نمو النسيلة خلال الأسبوع الثالث والرابع من النمو.

تكرار تغيير الوسط الغذائي كل أسبوع. راجع البروتوكول النصي للاطلاع على طرق التوسع النسيلي. افحص supernatant الناتج عن تغييرات الوسط الغذائي للكشف عن إنتاج IgG باستخدام مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم أو Eliza.

أولاً، قم بتجهيز أطباق ELISA عن طريق توزيع 50 µL من الأجسام المضادة لـ goat anti-human FC في كل بئر، مخففة بنسبة 1:200 في محلول التخفيف (coating buffer). بعد تحضين الطبق وغسله، قم بحجب الآبار باستخدام 100 µL من محلول الحجب (blocking buffer) لكل بئر ثم حضن الطبق مرة أخرى. بعد انتهاء فترة تحضين الحجب، قم بتفريغ السائل من الطبق على منشفة ورقية.

بعد تجهيز الطبق، خفف السوائل الطافية بأربعة أضعاف من حجم وسط RPMI. ثم بالنسبة لعناصر التحكم القياسية، قم بإجراء تخفيف تسلسلي لمحلول IgG البشري في وسط RPMI من 1000 nanograms per milliliter إلى 15.6 nanograms per milliliter.

قم بتضمين عينة فارغة (blank) أيضاً. ضع 50 µL من السائل الطافي أو المعيار في كل بئر، ثم حضن لوحة ELISA لمدة ساعة واحدة عند 37 °C بنفس الطريقة؛ ويمكن إعداد لوحات ELISA إضافية لتحليل تخفيفات أخرى من السوائل الطافية لاختبار ألفة الأجسام المضادة. بعد انتهاء فترة التحضين، اغسل اللوحة.

بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول الحضانة المنظم الذي يحتوي على fab two مقترن بإنزيم البيروكسيداز إلى كل بئر. وبعد ساعة أخرى من الحضانة وعملية غسيل أخرى، أضف 100 µL من محلول الركيزة الذي يحتوي على TMB إلى كل بئر، ثم حضّن اللوحة لمدة تصل إلى 10 دقائق حتى يستقر اللون الأزرق الظاهر.

بعد ذلك، قم بإيقاف التفاعل وقياس الامتصاصية. تُعتبر جميع سوائل الطافية للمستنسخات التي تظهر امتصاصية مقاسة تزيد بمقدار ثلاثة انحرافات معيارية عن العينة الفارغة موجبة.

بالنسبة للأجسام المضادة IgG البشرية، يمكن الكشف عن النوعية المستضدية عن طريق فحوصات إضافية. للبدء، اتبع البروتوكول النصي لتخليق DNA مكمل من النسخ للمستنسخات الموجبة. ثم قم بإعداد تفاعلات PCR لسلسلة IgG الثقيلة وكابا ولامدا.

في النتائج، ابحث عن السلسلة الثقيلة عند 400 إلى 550 زوج قاعدي. وابحث عن السلسلة الخفيفة عند 300 إلى 400 زوج قاعدي. في حال عدم وجودهما، استخدم ميكرولتر واحد من النواتج كقالب لتفاعل PCR آخر.

يجب أن تكون النواتج الجديدة ضمن النطاق المناسب. بعد ذلك، يتم البدء في استنساخ أفضل هذه النواتج. أولاً، يتم تحديد تسلسلها، ويجب أن تكون مخططات الرحلان الكهربائي (electropherograms) الخاصة بها واضحة وتتوافق مع تسلسل غلوبولين مناعي واحد.

باتباع البروتوكول المكتوب، يتم استنساخ ناتج PCR المنقى في ميكروغرام واحد من DNA البلازميد. تأكد من إجراء عملية الربط طوال الليل عند درجة حرارة 16 °C.

باستخدام T four DNA Ligase، قم بتحضير خلايا HX في وسط DMEM مكمل، ونمِّها حتى تصل درجة التلاقي إلى 75% في دوارق زراعة بمساحة 75 سنتيمتر مربع. ولكل عملية ترانسفكشن للسلسلة الثقيلة والخفيفة، قم بتحضير خليط يحتوي على 1.75 Milliliters من وسط DMEM الخالي من المصل، يشمل 4.5 micrograms من ناقل السلسلة الثقيلة، و3 micrograms من ناقل السلسلة الخفيفة، و50 microliters من محلول polyethaline. أضف هذا الخليط برفق إلى طبق من خلايا HX وقم بتدوير المحلول فوق الطبق.

يتم تحضين الطبق طوال الليل، ومن ثم البدء في جمع الأوساط الزرعية يومياً، واستبدالها بوسط خالٍ من المصل. تحتوي هذه الأوساط على الأجسام المضادة، ويمكن جمعها يومياً لمدة أربعة أيام بعد صبغ CD 22 وIgG، حيث تم فرز خلايا p BMCs الإيجابية بواسطة FACS.

تم جمع منطقة الخلايا إيجابية التعبير المزدوج، وهي خلايا B التي تنتج أجسام IgG المضادة، بشكل منفصل لغرض التوسيع. شكلت هذه المجموعة إيجابية التعبير المزدوج حوالي 1% من خلايا pbmc. وبعد خمسة أسابيع من التحفيز باستخدام EBV وCPG 2006، تم عزل المستنسخات المخلدة.

تتمتع الخلايا المغذية من نوع WI 30 بشكل أرومي ليفي أكثر استطالة، بينما تظهر مستنسخات الخلايا البائية كخلايا مستديرة صغيرة جداً تنمو في تجمعات في منتصف طبق متعدد الآبار ذي قاع مستدير. تم اختبار المادة الطافية للمستنسخات النامية باستخدام مقايسة ELIZA للكشف عن IgG. وقد تم تقييم المستنسخ الإيجابي بناءً على قيمة كانت تزيد بمقدار ثلاثة انحرافات معيارية عن قيمة العينة الفارغة.

أظهر ثلاث من السوائل الطافية على الأقل من مستنسخ إيجابي نتيجة إيجابية في اختبار الـ eli. تم تسلسل الأجسام المضادة من مستنسخ إيجابي بعد استنساخ المناطق المتغيرة والثابتة لزوج السلسلة الثقيلة وسلسلة lambda من الغلوبولين المناعي، حيث أمكن توصيف السلسلتين الثقيلة والخفيفة. باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل التسلسل للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالأجسام المضادة، واستخدام الجينات، والتنوع الجيني، وما إلى ذلك. وبعد هذا التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الذاتية لاستكشاف المرض، والباثولوجيا، والاستراتيجيات العلاجية ذات الصلة لأمراض المناعة الذاتية مثل الوهن العضلي الوبيل. وتمتد آثار هذه التقنية إلى تشخيص وعلاج أمراض مثل الوهن العضلي الوبيل لأن اكتشاف الأجسام المضادة المسببة للمرض يمكن أن يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة مثل الأجسام المضادة المنافسة التي تفتقر إلى النشاط الالتهابي.