على قناة واحدة وتحليل الكالسيوم التصوير في Podocytes من الكبيبات المعزولة حديثا

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا استجابةً للعوامل الدوائية. يتم تقدير المستويات الأساسية للكالسيوم وتقييم نشاط القنوات الفردية في الخلايا القدمية كجزء من الكبيبة الكلوية المعزولة حديثًا بالكامل. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الدم من كلى الجرذ من خلال الغسل عبر الأبهر البطني.

بعد ذلك، يتم استئصال الكليتين وعزل القشرة الكلوية وفرمها باستخدام شفرة حلاقة. وفي الخطوة الثالثة، يتم عزل الكبيبات القشرية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. بعد ذلك، يمكن إما إخضاع الكبيبات المعزولة والمقطوعة الرأس لتجارب الفيزيولوجيا الكهربائية أو تحميلها بأصباغ فلورية واستخدامها لقياسات تركيز الكالسيوم بالمجهر البؤري.

وفي نهاية المطاف، تُمكّن هذه الإجراءات الباحثين من تحديد التغيرات الحادة في التعامل مع الكالسيوم داخل الخلايا استجابةً لإضافة عوامل مختلفة، وتقييم والتحكم في موصلية الكالسيوم على مستوى القنوات الأيونية المنفردة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تتيح لنا دراسة الخلايا القدمية كجزء من الكبيبة الكلوية المعزولة بالكامل. كما يحافظ تحضيرنا على القدرة الوظيفية للخلايا القدمية.

تظل هذه الخلايا مرتبطة بالشعيرات الدموية وتشارك في التوازن الداخلي في البيئة التي يمكنها بالفعل الحفاظ على الأجزاء الرئيسية من جهاز الترشيح الكبيبي. وتوسع تداعيات هذه التقنية من نطاق الفحص الفارماكولوجي لدينا. وفي الحالات الطبيعية والمرضية، تؤدي آلية التعامل مع الكالسيوم بواسطة الخلايا القدمية دوراً تنظيمياً أساسياً في تطور ومنع المضاعفات الكلوية في أمراض مثل اعتلال الكلية السكري، أو تصلب الكبيبات القطعي البؤري، أو ارتفاع ضغط الدم. ومن الأهمية بمكان مراقبة استجابة تدفق الكالسيوم في هذه الخلايا للأدوية، والتي يمكن فحصها بسهولة.

في هذا التحضير، سيقوم VLA Hunka بتوضيح كيفية غسل الكلية من أجل الإجراءات التالية. سأعرض عملية عزل الكبيبات والفيزيولوجيا الكهربائية لـ V clamp، بينما سيرشدكم الدكتور GaN خلال التصوير المجهري متحد البؤر للكالسيوم. لبدء هذا الإجراء، ضع جرذاً مخدراً على طاولة جراحية يتم التحكم في درجة حرارتها. وتحت المجهر، قم بإجراء شق في خط المنتصف من البطن للكشف عن الوريد CVA والشريان الأورطي.

بعد ذلك، ضع الرباط حول الشرايين الزلاقي والمساريقي العلوي والشريان الأورطي البطني فوقهما. قم بتشريح الشريان الأورطي البطني تحت الشرايين الكلوية تشريحاً كليلاً. ثم ضع رباطين حوله، ولكن دون ربطهما.

قم بتثبيت الشريان الأورطي بمشبك فوق الربطات واربط الخيط السفلي. بعد ذلك، قم بقسطرة الشريان الأورطي باستخدام أنبوب بولي إيثيلين متصل بمضخة حقن مملوءة بـ PBS أسفل المشبك، وثبّت القسطرة بربطة ثانية. ثم قم بإزالة المشبك وربطهما.

الشرايين المعوية والمساريقية. يتم حقن الأبهر بمحلول PBS المبرد مسبقاً لمدة ثلاث دقائق وبمعدل 6 mL في الدقيقة. وفي الوقت نفسه، يتم إجراء شق في الوريد الأجوف بالقرب من الأوردة الكلوية لتخفيف الضغط.

بعد ثلاث دقائق، أوقف عملية التروية، ثم استأصل الكليتين وقم بتغليفهما. ضعهما في محلول PBS على الثلج. الآن قم بتحضير 30 milliliters من محلول 5%BSA طازج في وسط RPMI 1640.

باستخدام شفرة حلاقة ومقص، قم بعزل القشرة من كلتا الكليتين، ثم قم بفرمها حتى تصبح متجانسة. بعد ذلك، ادفع النسيج المفروم عبر منخل من الفولاذ المقاوم للصدأ بفتحات قياس 100 mesh يكون قد نُقع مسبقاً في محلول 5%P-S-A-R-P-M-I. اجمع السائل المار واسمح له بالمرور عبر منخل بفتحات قياس 140 mesh.

بعد ذلك، قم بترشيح التدفق المجمّع من المنخل ذي المسام 140 باستخدام منخل ذي مسام 200 منقوع مسبقاً. تخلص من الراشح واغسل المنخل العلوي بـ 10 إلى 15 milliliters من محلول B-S-A-R-P-M-I المُحضّر واجمع الكبيبات من أعلى المنخل. بعد ذلك، ضع محلول B-S-A-R-P-M-I الذي يحتوي على G Glomeruli في أنبوب 15 milliliter، واترك الكبيبات تترسب في قاع الأنبوب لمدة تصل إلى 20 minutes.

في هذا الإجراء، تُطلى رقائق غطاء زجاجي بمقاس 5 × 5 مليمتر بـ poly lysine بوزن جزيئي يتراوح من 70,000 إلى 150,000، ثم تُجفف على لوح ساخن. بعد ذلك، يتم تدفئة المحاليل التجريبية حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، ويُملأ حجرة patch clamp والماصة. اخلط المحلول الذي يحتوي على الكبيبات الرينانية (glomeruli) بلطف، ثم ضع حوالي 50 µL منه على كل رقاقة غطاء زجاجي مطلية بـ polylysine.

بعد ذلك، انقل الشرائح الزجاجية التي تحتوي على الكبيبات إلى غرفة تثبيت الرقعة (patch clamp)، والتي تكون مملوءة مسبقاً بمحلول Beth. يتم تروية الغرفة بمعدل 3 mL في الدقيقة الواحدة لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي كبيبات غير ملتصقة قبل إجراء تسجيل تثبيت الرقعة التقليدي في وضع الخلية الملتصقة (cell attached mode).

ضع الآن 500 µL من جزء الكبيبات في كل أنبوب مخروطي سعة 0.5 mL، وأضف صبغات الكالسيوم pure red am و flu oh 4:00 AM. بعد ذلك، ضع الأنابيب على هزاز دوار لمدة تصل إلى ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم جهز شرائح التغطية الزجاجية باستخدام البولي ليسين واتركها تجف على لوح تسخين عند 70 °C. وبمجرد اكتمال تحميل صبغات الكالسيوم، ضع 100 µL من المحلول الذي يحتوي على الكبيبات على شرائح التغطية المطلية بالبولي ليسين واتركها تلتصق بالسطح لمدة خمس دقائق تقريباً.

بعد ذلك، ثبّت شرائح التغطية الملتصق بها الكبيبات على غرفة التصوير، ثم قم بترويتها بمحلول الحمام بمعدل 3 mL في الدقيقة لإزالة الكبيبات غير الملتصقة والصبغات المتبقية. بعد ذلك، اضبط المجهر الماسح الليزري البؤري على طول موجي للإثارة يبلغ 488 nm. ثم اضبط برنامج التصوير على التردد والدقة المطلوبين.

بعد ذلك، حدد الكبيبات في وضع المجال المضيء. ثم قم بتفعيل كشف إشارة الفلورية. بعد ذلك، اختر المستوى البؤري المطلوب وتحقق من شدة الفلورية في قناتي flu oh four و firo red.

تأكد من رؤية الكبيبة بوضوح في مجال السطوع (brightfield). ثم سجل التغيرات في شدة الفلورسنت لإشارات flu oh four و furor red. لاستيراد تسلسل الصور، قم بفصل القنوات واستخدم وضع التدرج الرمادي للمكدس الفائق (hyper stack gray scale mode).

في برنامج Image J، افتح نافذة مدير مناطق الاهتمام (ROI manager) باتباع المسار: analyze tools، ثم ROI Manager. حدد منطقة اهتمام واحدة أو أكثر باستخدام أداة التحديد البيضاوية (oval selection tool) ووظيفة add T في مدير مناطق الاهتمام. بعد ذلك، حدد المنطقة في الخلفية واحفظ مناطق الاهتمام (ROIs) التي تم تحديدها.

بعد ذلك، حدد مربع "صف واحد لكل شريحة" (one row per slice) في مربع الحوار، ثم انقر فوق "موافق" (okay) في خيارات قائمة النتائج. قم بضبط القياسات؛ اختر "متوسط القيمة الرمادية" (mean gray value)، واحسب قيم كثافة البكسل لكل منطقة اهتمام (ROI)، والتي ستظهر في نافذة النتائج في أعمدة منفصلة.

بعد ذلك، قم بنسخ قيم شدة ROI المقاسة لكل قناة لكل ROI إلى برنامج تحليل البيانات المفضل، واطرح قيم شدة الخلفية من كل نقطة بيانات لكل نقطة زمنية. احسب نسبة شدة قنوات flu oh four إلى URA red، ثم قم برسم التغيرات الزمنية لعابر الكالسيوم لكل ROI. تُظهر هذه الصورة ماصة patch clamp وهي متصلة بجسم الأكسيد على سطح الكبيبة الكلوية للجرذ.

أثناء التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي، يمكن رؤية جزء من كبيبة محفظة في الزاوية اليمنى السفلية من الصورة. يظهر هنا تتبع ممثل للتيار لنشاط القنوات الشبيهة بـ tripy من رقعة خلية ملتصقة تم إجراؤها على الخلية القدمية لقياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. يتم تحميل الكبيبات بـ flu oh 4:00 AM لوسم الكالسيوم داخل الخلايا.

يوضح هذا الفيديو تأثيرات CIN وكلوريد المنجنيز على تدفق الكالسيوم في الكبيبات. يحدد هذا الرسم البياني كمياً التغيرات في شدة إشارة flu oh four المسجلة من خلية قدمية واحدة استجابةً لـ CIN وكلوريد المنجنيز. وكما هو متوقع، ينتج عن CIN أقصى حد من الفلورة، بينما يعمل كلوريد المنجنيز على إخماد الصبغة مما يؤدي إلى أدنى شدة فلورة.

يتيح تطبيق هذه العقاقير للباحث تحديد تركيز الكالسيوم الدقيق داخل الخلية لاحقاً. يوضح هذا الفيديو تأثير 10 micromole من a TP على تركيز الكالسيوم في الكبيبات. لاحظ وجود زيادة في فلورية flu O four الخضراء وانخفاض في فلورية fu red الحمراء، مما يشير إلى زيادة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا.

توفر هذه التقنية فرصة فريدة لمراقبة التغيرات في تدفق الكالسيوم على مستوى القناة الأيونية الواحدة والخلايا الفردية بعد العلاجات الدوائية أو التدخلات الأخرى. وبناءً على ذلك، يمثل هذا النهج أداة قوية للغاية بالنظر إلى النماذج المتعددة المتاحة من القوارض المعدلة وراثياً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء قياسات تدفق الكالسيوم في الخلايا القدمية، بالإضافة إلى تجارب تثبيت الجهد الكهربائي الفسيولوجية التي تُستخدم إما بالتزامن معها أو بشكل مستقل.

توفر هذه التقنيات رؤية ميكانيكية ومعمقة حول تنظيم التعامل مع الكالسيوم في الخلايا القدمية في الحالات الطبيعية والمرضية.