على قناة واحدة وتحليل الكالسيوم التصوير في Podocytes من الكبيبات المعزولة حديثا

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا استجابة للعوامل الدوائية. تقدير المستويات القاعدية للكالسيوم وتقييم نشاط القناة الفردية في الخلايا البودية كجزء من الكبيبة المعزولة حديثا بالكامل. يتم تحقيق ذلك عن طريق تطهير الدم أولا من كلى الفئران عن طريق التنظيف عبر الشريان الأورطي البطني.

بعد ذلك ، يتم حصاد الكلى وعزل قشرة الكلى وفرمها بشفرة حلاقة. في الخطوة الثالثة ، يتم عزل الكبيبات القشرية عن طريق التفاضل. بعد ذلك ، يمكن أن تخضع الكبيبات المقطوعة الرأس المعزولة لتجارب الفيزيولوجية الكهربية أو محملة بأصباغ الفلورسنت وتؤخذ لقياسات تركيز الكالسيوم متحد البؤر.

في النهاية ، تمكن هذه الإجراءات الباحثين من حل التغييرات الحادة في التعامل مع الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لتطبيقات العوامل المختلفة وتقييم توصيل الكالسيوم ومعالجته على مستوى القنوات الأيونية الواحدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها تسمح لنا بدراسة الخلايا البودوية كجزء من الكبيبة المعزولة بأكملها. يحتفظ تحضيرنا بالإمكانيات الوظيفية للخلايا البودية.

يظلون مرتبطين بالشعيرات الدموية ويشاركون في التوازن في البيئة التي يمكن أن تحافظ في الواقع على الأجزاء الرئيسية من جهاز ترشيح الكبيبات. الآثار المترتبة على هذه التقنية توسيع نطاق الفحص الدوائي لدينا في الحالات الطبيعية والمرضية ، تؤدي آلية التعامل مع الكالسيوم بواسطة الخلايا البودية دورا تنظيميا أساسيا في تطوير والوقاية من المضاعفات الكلوية في أمراض مثل اعتلال الكلية السكري أو الجزء البؤري تصلب الأومن أو ارتفاع ضغط الدم. من الأهمية بمكان ملاحظة استجابة تدفق الكالسيوم في هذه الخلايا للأدوية ، والتي يمكن فحصها بسهولة.

في هذا المستحضر ، سيوضح VLA Hunka كيفية طرد الكلى للإجراءات التالية. سأعرض عزل الكبيبات والفيزيولوجيا الكهربية للمشبك V ، وسوف يرشدك الدكتور GaN من خلال تصوير الكالسيوم متحد البؤر. لبدء هذا الإجراء ، ضع فأرا مخدرا على طاولة جراحية يتم التحكم في درجة حرارتها تحت المجهر ، قم بعمل شق خط الوسط على البطن للكشف عن الوريد CVA والشريان الأورطي.

بعد ذلك ، أدخل الرباط حول الاضطرابات الهضمية والشرايين المساريقية العلوية والشريان الأورطي البطني فوقها. حادة ، تشريح الشريان الأورطي البطني أسفل الشرايين الكلوية. ثم ضع اثنين من الرباطات حوله ، لكن لا تربطه.

قم بتثبيت الشريان الأورطي فوق الأربطة واربط الخيط السفلي. بعد ذلك ، قم بقسطرة الشريان الأورطي بأنبوب بولي إيثيلين متصل بمضخة حقنة مملوءة ب PBS أسفل المشبك وقم بتثبيت القسطرة برباط ثان. ثم قم بإزالة المشبك وربطها.

لي الشرايين المعوية والاضطرابات الهضمية. قم بنقع الشريان الأورطي مع PBS المبرد مسبقا لمدة ثلاث دقائق بمعدل ستة ملليلتر في الدقيقة. في الوقت نفسه ، قم بعمل شق في وريد الأجوف بالقرب من الأوردة الكلوية لتخفيف الضغط.

بعد ثلاث دقائق ، أوقف التروية والاستئصال وتغليف الكلى. ضعها في محلول PBS على الثلج. قم الآن بإعداد 30 مل من 5٪ BSA الطازج في وسط RPMI 1640.

باستخدام شفرة حلاقة ومقص ، اعزل قشرة كلتا الكليتين ، ثم قم بتقطيعهما حتى تصبح متجانسة. بعد ذلك ، ادفع الأنسجة المفرومة من خلال منخل من الفولاذ المقاوم للصدأ 100 شبكة تم نقعها مسبقا في محلول 5٪ P-S-A-R-P-M-I. اجمع التدفق من خلال واتركه يمر عبر 140 شبكة siv.

بعد ذلك ، قم بتصفية التدفق الذي تم جمعه من خلال المنخل الشبكي 140 باستخدام 200 شبكة منقوعة مسبقا. تخلص من المرشح واغسل المنخل العلوي ب 10 إلى 15 مل من محلول B-S-A-R-P-M-I المحضر واجمع الكبيبات من أعلى المنخل. بعد ذلك ، ضع محلول B-S-A-R-P-M-I الذي يحتوي على G Glomeruli في 15 ملليلتر ، اثنين من الثلج واترك رواسب الكبيبات في قاع الأنبوب لمدة تصل إلى 20 دقيقة.

في هذا الإجراء ، قم بتغطية رقائق زجاجية بخمسة ملليمترات بوزن جزيئي ، 70 ، 000 إلى 150 ، 000 بولي ليسين وجففها على طبق ساخن. بعد ذلك ، قم بتسخين المحاليل التجريبية لدرجة حرارة الغرفة واملأ حجرة مشبك التصحيح والماصة امزج المحلول المحتوي على الكبيبات برفق. ثم ضع ما يقرب من 50 ميكرولترا منه على كل شريحة زجاجية مطلية بالبولي لايسين.

بعد ذلك ، انقل الرقائق الزجاجية مع الكبيبات إلى غرفة مشبك التصحيح. معبأة مسبقا بمحلول بيث. قم بنشر الغرفة بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي كبيبات غير متصلة قبل إجراء تسجيل مشبك التصحيح التقليدي في وضع توصيل الخلية.

الآن ضع 500 ميكرولتر من جزء الكبيبات في كل أنبوب مخروطي سعة 0.5 مليلتر وأضف أصباغ الكالسيوم أحمر نقي وأنفلونزا أوه 4:00 صباحا. بعد ذلك ، ضع الأنابيب على شاكر دوار لمدة تصل إلى ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإعداد زلات الغطاء الزجاجي بالبولي ليسين واتركها تجف على اللوحة الساخنة عند 70 درجة مئوية. بمجرد اكتمال تحميل قوالب الكالسيوم ، ضع 100 ميكرولتر من محلول الكبيبات المحتوي على زلات الغطاء المطلي بالبولي ليسين واتركها تلتصق بالسطح لمدة خمس دقائق تقريبا.

ثم قم بتركيب الكبيبات المرفقة بالغطاء على غرفة التصوير وقم بتكليفها بمحلول الاستحمام بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة لإزالة الكبيبات غير المتصلة والأصباغ المتبقية. بعد ذلك ، اضبط مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر على طول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر. ثم اضبط برنامج التصوير على التردد والدقة المطلوبين.

بعد ذلك ، ابحث عن الكبيبات في الحقل الساطع. قم بتشغيل الكشف عن إشارة التألق بعد ذلك. بعد ذلك ، حدد المستوى البؤري المطلوب وتحقق من شدة التألق على الأنفلونزا أوه أربعة وقنوات فيرو الحمراء.

تأكد من رؤية الكبيبة بوضوح في الحقل الساطع. ثم سجل التغييرات في شدة التألق للأنفلونزا أوه أربعة والإشارات الحمراء الغضبية. لاستيراد تسلسل الصورة ، قم بتقسيم القنوات واستخدم وضع المقياس الرمادي للمكدس الفائق.

في برنامج Image J ، افتح نافذة مدير عائد الاستثمار باتباع أدوات التحليل ، مسار مدير ROI. حدد منطقة اهتمام واحدة أو أكثر باستخدام أداة تحديد بيضاوية ووظيفة إضافة T في مدير عائد الاستثمار. ثم حدد المنطقة الموجودة في الخلفية واحفظ عائد الاستثمار المحدد.

بعد ذلك ، ضع علامة على مربع صف واحد لكل شريحة في مربع الحوار وانقر فوق موافق في نتائج خيارات القائمة. ضبط القياسات. حدد متوسط القيمة الرمادية، واحسب قيم كثافة البكسل لكل عائد استثمار، والتي سيتم عرضها في نافذة النتائج في أعمدة منفصلة.

لكل عائد استثمار ، انسخ قيم شدة عائد الاستثمار المقاسة لكل قناة إلى برنامج تحليل البيانات المفضل ، واطرح قيم شدة الخلفية من كل نقطة بيانات لكل نقطة زمنية. احسب نسبة شدة الأنفلونزا أوه أربعة إلى قنوات URA الحمراء بعد هذا الرسم ، وتغيرات وقت النقطة للكالسيوم العابر لكل عائد استثمار. توضح هذه الصورة ماصة المشبك الرقعة المتصلة بجسم الأكسيد على سطح كبيبة الفئران.

أثناء التسجيل الفيزيولوجي الكهربي ، يمكن رؤية جزء من الكبيبة المغلفة في الزاوية السفلية اليمنى من الصورة. فيما يلي أثر حالي تمثيلي لنشاط القنوات الثلاثية الشبيهة ب خلية من رقعة متصلة بالخلية مصنوعة على الخلية لقياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. يتم تحميل الكبيبات بالإنفلونزا أوه 4:00 صباحا لتسمية الكالسيوم داخل الخلايا.

هذا الفيديو تأثيرات CIN وكلوريد المنغنيز على تدفق الكالسيوم في الكبيبات. يحدد هذا الرسم البياني التغيرات في كثافة إشارة الأنفلونزا الأربعة المسجلة من خلية واحدة استجابة ل CIN وكلوريد المنغنيز. كما هو متوقع ، ينتج CIN الحد الأقصى من التألق ويقوم كلوريد المنغنيز بإخماد الصبغة وينتج عنه أقل كثافة مضانة.

يسمح تطبيق هذه الأدوية للباحث بتحديد تركيز الكالسيوم الدقيق داخل الخلية لاحقا. يوضح هذا الفيديو تأثير 10 ميكرومول TP على تركيز الكالسيوم في الكبيبات. لاحظ أن هناك زيادة في الأنفلونزا الخضراء O أربعة مضان وانخفاض في التألق الأحمر فو الأحمر ، مما يمثل زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا.

توفر هذه التقنية فرصة فريدة لمراقبة التغيرات في تدفق الكالسيوم على مستوى القناة الأيونية المفردة والخلايا الفردية بعد العلاجات الدوائية أو التلاعب الآخر. وبالتالي ، يمثل هذا النهج أداة قوية للغاية مع الأخذ في الاعتبار العديد من نماذج القوارض المعدلة وراثيا المتاحة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء قياسات الكالسيوم في الخلايا الجسدية ، بالإضافة إلى الفيزيولوجيا الكهربية ، والتي يتم استخدام التجارب معا من تلقاء نفسها.

توفر هذه التقنيات نظرة متعمقة وميكانيكية لتنظيم التعامل مع الكالسيوم مع الخلايا البودية في الظروف العادية والمرضية.