التصوير المباشر لالبطانة العصبية سيليا في البطينات الجانبية للدماغ الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير ملاحظة خارج الجسم الحي (ex vivo) لنبض Motr append CLIA الموجودة داخل بطينات دماغ الفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق استئصال الدماغ كاملاً أولاً، ثم الحصول على قطاعات رقيقة من خلال البطينات الجانبية. بعد ذلك، يتم تحضين الشرائح في طبق زجاجي القاع مخصص يحتوي على وسط غني بالجلوكوز في درجة حرارة الجسم للحفاظ على حيوية الأنسجة أثناء التجربة.

أخيرًا، يتم تسجيل ضربات الأهداب باستخدام مجهر تباين التداخل التفاضلي عالي الدقة. وفي النهاية، يمكن تصور بنية الأهداب وتمركز البروتين فيها عن طريق التصوير بالفلورة المناعية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطريقتنا الحالية في أنها أول تقنية تسمح بتصنيف الخلايا البشرية إلى ثلاث مجموعات متميزة بناءً على ترددات وزوايا تكرار ضربات الأهداب الفريدة الخاصة بها.

هذا أمر جيد. تمتد آثار هذه التقنية نحو علاج استسقاء الرأس، حيث يؤدي الخلل في وظيفة CLIA البشرية إلى تراكم السائل الدماغي الشوكي في الدماغ.

البطينات ستقوم السيدة زها علم والآنسة هناء سات، وهما طالبتان موهوبتان جداً من مختبرنا، بشرح الإجراء. ابدأ بتنظيف رأس فأر بالغ باستخدام 70% ethanol. ثم بدءاً من أعلى الرأس، استخدم مقصاً وملاقط معقمة لإزالة الجلد وكشف الجمجمة.

بعد ذلك، قم بتعافي العظم قطعة تلو الأخرى، بدءاً من الجانب الخلفي والتحرك باتجاه الجانب الأمامي. لإزالة الجمجمة، استأصل الدماغ بالكامل وضعه في طبق بتري بحجم 100 millimeter يحتوي على وسط عالي الجلوكوز عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. باستخدام شفرة حادة، قم بتقطيع الدماغ على المستوى السهمي الناصف للحصول على المقطع الأول بسمك 100 إلى 200 micron من كل نصف.

بعد ذلك، اشطف المقاطع بمحلول PBS عند درجة حرارة 37 °C، وضع النسيج فوراً في وسط جلوكوز للعين عند درجة حرارة 37 °C لتصوير المقاطع، وضع شرائح الدماغ في أطباق زراعة ذات قاع زجاجي بحجم 30 millimeter تحتوي على 1 mL من وسط جلوكوز عالي التركيز، واضبط بيئة غرفة المجهر المغلقة عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide باستخدام عدسة غمر زيتية بقوة 60 x. بعد ذلك، قم بتركيز الرؤية على الخلايا باستخدام الضوء النافذ المعتاد بتقنية DIC.

بعد ذلك، تتبع اتجاه حركة فقاعة DMEM كدليل لتحديد موقع الخلايا الهدبية الملحقة (append clia) المتحركة. استخدم مرشح DIC لاختيار منطقة تحتوي على خلايا سليمة بها CLIA متحركة في البطين الجانبي للدماغ. وعند تحديد الخلايا الهدبية الملحقة، اضبط الإضاءة والتركيز للحصول على صورة مرضية.

بعد ذلك، قم بضبط معاملات التصوير الحي في برنامج التصوير. على سبيل المثال هنا، يتم الحصول على صور بدقة 24 bit مع ضبط تكبير الكاميرا على 1x مدمجاً مع عدسة شيئية 60x وزمن تعريض يتراوح بين 5 إلى 10 millisecond. افتح فتحة المجهر إلى المستوى الأمثل لتحقيق أدنى زمن تعريض، ثم قم بجمع صور DIC.

راقب الصور الحية التي يتم بثها إلى الكاميرا لتوفير الحصول على الصور بشكل سريع وفوري دون تأخير. يمكن بعد ذلك حساب سرعة نبضات القلب بناءً على متطلبات الحد الأدنى من أوقات التعرض للحصول على تباين كافٍ في الصورة لتسجيل إشارات الكالسيوم. بعد تقطيع الدماغ، اشطف النسيج لفترة وجيزة في PBS ثم قم فوراً بحضن المقاطع في 20 micrograms per milliliter من lu O2 المحضر حديثاً في طبق زجاجي القاع.

بعد مرور 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، سجل تذبذب الكالسيوم بمعدل التقاط قدره خمسة ملي ثانية لمدة ثانية واحدة على الأقل. أولاً عند طول موجي للإثارة يبلغ 488 نانومتر، ثم عند طول موجي للانبعاث يبلغ 515 نانومتر. ولتصوير علامات الخلايا المستهدفة باستخدام مجهر الفلورة المناعية، قم بتثبيت العينات في 4% para formaldehyde و 2% sucrose في PBS لمدة 10 دقائق.

اغسل النسيج ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. ثم حضّن شرائح الدماغ في 0.1% Triton X لمدة خمس دقائق. بعد شطف العينات كما تم توضيحه للتو، حضّنها باستخدام mouse anti acetylated alpha tubulin.

بعد غسلة أخرى بمحلول PBS، يتم تحضين العينات في جسم مضاد لـ IgG البشري مُوسوم بالفلوريسين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وأخيرًا، يتم صبغ المقاطع صبغة تباينية باستخدام DPI لمدة خمس دقائق، ثم يتم تصوير الخلايا فوراً بأقل وقت تعريض ممكن. يتم تأكيد وجود CLIA من منطقة العضلة المخططة باستخدام مؤشر هدبي وهو acetylated alpha tubulin مع الصبغ التبايني بـ DPI. ولتحديد النوى، يتم تحليل تدفق حركية CLIA من منطقة العضلة المخططة عن طريق حساب تردد الخفقان ونمط الزاوية للخلايا المتحركة.

يمكن بعد ذلك تقسيم CLIA إلى واحدة من ثلاث مجموعات بناءً على هذه البيانات. ومن المهم ملاحظة أن تعريض CLIA إلى 0.25%Ethanol يثبط بشكل ملحوظ تردد ضربات CLIA بغض النظر عن نوعها. كما يؤدي المزيد من ثني CLIA إلى تحفيز إشارات الكالسيوم داخل الخلوية المعتمدة على الهدب، مما يسمح بقياس إشارة الكالسيوم داخل الخلوية داخل بطينات الدماغ. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ساعة واحدة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل مع أنسجة الدماغ برفق وكفاءة، وذلك لتجنب تدمير بطينات الدماغ بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم الأعصاب لاستكشاف وظيفة append CLIA وأنسجة دماغ الفأر الحية.