في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

لدراسة تفاعل البكتيريا مع الأوعية الدموية تحت إجهاد القص ، يتم وصف غرفة التدفق ونموذج الفحص المجهري داخل الحياة المساريقية في الجسم الحي الذي يسمح بتشريح العوامل البكتيرية والمضيفة التي تساهم في التصاق الأوعية الدموية.

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في التفاعل بين البكتيريا والبطانة والبطانة الفرعية تحت الإجهاد المطلق. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات الفلورية على البكتيريا لتصورها في الوقت الفعلي باستخدام الفحص المجهري بالفيديو كخطوة ثانية. تستخدم غرفة التدفق في المختبر لدراسة اللاعبين المختلفين المشاركين في التصاق البكتيريا المتدفقة بالمكونات الخلوية أو المصفوفة.

بعد ذلك ، تتم دراسة التفاعلات المحددة في النموذج المختبري في نموذج نضح المساريق في الجسم الحي لاختبار أهميتها في كائن حي معقد ، وتظهر النتائج أن المكورات العنقودية الرئوية قادرة على الالتصاق بالخلايا البطانية المنشطة وبالبطانة الفرعية تحت إجهاد القص. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها تتضمن كلا من النموذج في المختبر ونموذج في الجسم الحي ، وهما مكملان لدراسة التسبب في الالتهابات داخل الأوعية الدموية تحت الضغط المطلق. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض المعدية وبيولوجيا الأوعية الدموية ، مثل كيفية إنشاء التهاب الشغاف المعدي والالتهابات النقيلية تحت الإجهاد الفسيولوجي المطلق ، مما يدل على إجراء من خلال Be Malin يبدو فنيا متخصصا في العمل الحيواني من مختبرنا Begin عن طريق تحضير صبغة الفلورسنت المستخدمة لتتبع البكتيريا.

أضف 150 ميكرولترا من محلول الفلورسنت الكربوكسي إلى 850 ميكرولتر من الماء المختبري واخلطه. قم بتخزين المحلول المحمي من الضوء عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة إليه. الحبيبات التالية ، ثقافة خمسة ملليلتر من S reus.

تغسل البكتيريا التي تزرع بين عشية وضحاها في مرق الصويا التربتيك مرة واحدة باستخدام PBS ثم تعيد تعليقها. تضيف الحبيبات الجديدة في 800 ميكرولتر من PBS 200 ميكرولتر من محلول الصبغة إلى الخلايا المعلقة لتجارب التروية في المختبر ، أو 400 ميكرولتر من محلول الصبغة. بالنسبة للتجارب في الجسم الحي ، قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لمنع التبييض الضوئي للصبغة واحتضانها على شاكر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 6٪ محلول ألبومين مصل الأبقار في PBS إلى الخليط لمنع الارتباط غير المحدد. تحقق من تركيز الخلايا باستخدام القياس الخلوي البصري وقم بتخفيف البكتيريا في PBS بتركيزات مختلفة حسب تطبيقها. بمجرد تخفيفها ، قم بحماية الأنابيب من الضوء وضعها على الجليد.

تمييع فون فاند عامل في الماء من الدرجة المختبرية إلى تركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام لكل ملليلتر. قم أيضا بتخفيف الكولاجين في محلول الجلوكوز متساوي التوتر إلى تركيز نهائي يبلغ 160 ميكروغرام لكل ملليلتر. ثم قم بإسقاط 200 ميكرولتر من كل طلاء على شريط من الطفيلي.

ضع زلات الغطاء فوق القطرات لتغطيتها بالبروتينات. احتضان زلة الغطاء في وعاء رطب لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. ثم ارفع زلات الغطاء بعناية من الطفيلي بإبرة حادة وقم بتركيب زلة الغطاء في الجزء السفلي من غرفة التدفق لإجراء تجارب على الخلايا البطانية ، وقم بتغطية الزلات البلاستيكية بمليلتر واحد من محلول الجيلاتين 1٪ في PBS واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

ثم بذر الخلايا البطانية للوريد السري البشري على زلات بلاستيكية مغلفة بالجيلاتين وتنميها إلى 70 إلى 80٪ من الطلاقة. قم بتركيب زلة الغطاء المطلية بالبروتين أو الانزلاق البلاستيكي المطلي بالخلية البطانية في الجزء السفلي من غرفة التدفق. ثم قم بتوصيل أنبوب المدخل والمخرج بالجزء العلوي من غرفة التدفق وقم بتوصيل أنبوب المخرج بحاوية نفايات.

ضع الجزء العلوي من غرفة التدفق برفق في الجزء السفلي وقم بتجميع غرفة التدفق. مع تجنب تكوين فقاعات الهواء. قم بحقن مليلتر واحد من الوسط من خلال الغرفة للتأكد من أن الغرفة لا تتسرب ولإزالة محلول الطلاء الزائد.

بعد ذلك ، قم بإعداد مضخة التسريب لحقنة سعة مليلتر واحد بحيث تتدفق بسرعة 75 ميكرولتر في الدقيقة. من خلال العمل في غرفة مظلمة ، املأ حقنة سعة مليلتر واحد بمليلتر واحد من البكتيريا المصنفة بالفلورسنت وضعها في مضخة التسريب. قم بتوصيل مخرج المحقنة بمدخل غرفة التدفق.

مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء ، ابدأ تشغيل مضخة التسريب لمدة 10 دقائق بسرعة 75 ميكرولتر في الدقيقة. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة المحقنة الأولى وقم بتوصيل حقنة سعة مليلتر واحد تحتوي على PBS أو DMEM بأنبوب المدخل. ابدأ التسريب والضخ واشطفه لمدة 10 دقائق لغسل أي بكتيريا غير مرتبطة.

بمجرد شطفها ، اترك مضخة التسريب قيد التشغيل والتقط ما لا يقل عن 15 صورة بالأبيض والأسود باستخدام وقت تعريض للضوء يبلغ 1.5 ثانية في مواقع عشوائية ، منتشرة على السطح المطلي لغرفة التدفق. باستخدام برنامج تحليل الصور مثل Image J.Subtract الخلفية لإزالة الخلفيات المستمرة السلسة من الصورة وتحديد العتبة لتعيين قيم العتبة السفلية والعليا ، والتي تقسم الصور ذات المقياس الرمادي إلى ميزات ذات أهمية. ثم قم بقياس المنطقة التي تقتصر على العتبة التي تم إنشاؤها حديثا واحفظ هذه القيمة المعروفة باسم منطقة الفلورسنت لكل عينة.

تم اختباره بسرعة على الفئران البالغة من العمر ثمانية أسابيع في الليلة السابقة للتجربة لتقليل حركة الأمعاء. يبدأ يوم التجربة بحقن 0.1 ملليغرام من البوبرينورفين لكل كيلوغرام من وزن الجسم كمسكن. بعد ذلك ، قم بتخدير الماوس وتطبيق مرهم على العينين.

ضع الماوس على وسادة التسخين التي يتم التحكم فيها بالحرارة أسفل نطاق التشريح واختبر أن الماوس لا يظهر أي منعكس بتلة. قم بعمل شق سنتيمتر واحد مواز للوريد الوداجي. قم بإزالة الجانب الأيمن من عضلة عنق الرحم ثم عزل الوريد الوداجي عن الأنسجة المحيطة.

أدخل قسطرة فرنسية في الوريد الوداجي الأيمن وثبتها في مكانها باستخدام الغرز. ثم قم بعمل شق في البطن في خط الوسط لفتح التجويف البريتوني. ضع الماوس على جانبه الأيمن على لوحة شفافة وقم بتأمين القنية بشريط لاصق.

اسحب الأمعاء برفق باستخدام مسحات قطنية وانشر المساريق. لتصور الشرايين المساريقية والدورة الدموية. ضع كمادات ساخنة فوق الماوس لمنع انخفاض حرارة الجسم وقم بإسقاط 500 ميكرولتر من 0.9٪ من NACL على الأمعاء كل 30 دقيقة لمنع جفاف الأنسجة.

استخدم مسحات القطن لشل حركة الأوعية وتصورها تحت المجهر المقلوب. بعد ذلك ، ضع خمسة ميكرولترات من محلول 10 ملليمولار من أيون الكالسيوم أربعة مذاب في DMSO. سيؤدي ذلك إلى تنشيط إطلاق Von Villa Brandt ، العامل من الخلايا البطانية في الأوعية.

بعد 10 ثوان ، قم بحقن 100 ميكرولتر من البكتيريا المصنفة بالفلورسنت من خلال القسطرة الوداجية. في هذا الوقت ، ابدأ في التقاط صور بفاصل زمني ، واحصل على صور بفاصل زمني باستخدام أداة الاكتساب في شريط الأدوات باستخدام 40 دورة من 1000 صورة في الثانية. بمجرد اكتمال الحصول على الصورة ، قم بالقتل الرحيم للماوس وفقا للإرشادات المؤسسية.

احفظ الصور بتنسيق ملف صورة مناسب ، ثم قم بمعالجة الصور باستخدام برنامج تحليل الصورة J كما هو موضح سابقا للتأكيد على دور الإجهاد المطلق على الالتصاق البكتيري ، وتم إجراء تروية المكورات العنقودية الذهبية بمعدلات قص مختلفة على زلات الغطاء المطلية بعامل Von Vbr. مع زيادة المعدلات الهائلة ، يزداد الالتصاق البكتيري أيضا مما يشير إلى أن قوى القص العالية لا تمنع ، ولكنها تعزز التصاق البكتيريا بالبروتين. في حالة عدم وجود عامل فون فاند ، انخفض التصاق المكورات العنقودية الذهبية بالكولاجين مع زيادة معدلات القص.

ومع ذلك ، عندما كان عامل فون فاند موجودا في الوسط ، زاد التصاق البكتيريا مع زيادة معدلات القص ، وأظهرت الخلايا البطانية التي تم تنشيطها باستخدام أيون الكالسيوم أربعة لإطلاق عامل الرافعة التصاق بكتيري أكثر بكثير من الخلايا غير المنشطة. بالإضافة إلى ذلك ، شكلت البكتيريا سلسلة نموذجية مثل أنماط المجموعات البكتيرية المصنفة بالفلورسنت والتي تمت محاذاتها في اتجاه القوة الهائلة ، مما يشير إلى ارتباط البكتيريا على طول جزيء VWF ممتد خطي لاختبار تأثير عامل Von Vbr في الخلايا البطانية في الجسم الحي للدورة الدموية المساريقية تم تنشيطها لإطلاق عامل von Vbr ، ثم تم إدخال الخلايا البكتيرية المصنفة بالفلورسنت في مجرى الدم. البكتيريا التصقت محليا بجدار الوعاء الدموي المنشط وشكلت الركام.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية التحقيق في التفاعل مع البكتيريا وجدار الوعاء الدموي على إجهاد القص عن طريق وضع العلامات الفلورية على البكتيريا وتصورها في كل من غرفة التدفق في المختبر وفي نموذج وفرة المساريقية الحيوية داخل الجسم الحي. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التهابات القلب والأوعية الدموية لاستكشاف التفاعل بين مسببات الأمراض وجدار الأوعية الدموية في التهاب الشغاف المعدي والالتهابات النقيلية.