جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات من خلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري التي تم الحصول عليها من معاطف بافي المجمدة باستخدام بروتوكول فعال من حيث التكلفة وخالي من الفيروسات. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق عزل PB MNCs من معاطف Buffy بعد الطرد المركزي للدم الكامل دون تدرج الكثافة متبوعا بالتوسع في وسط زراعة دم معين. الخطوة الثانية هي نقل MNCs ذات معطف بافي PB مع البلازميدات العرضية عن طريق التثقيب الكهربائي.

ثم يتم طلاء الخلايا متعددة الجنسيات PB المنقولة على خلايا مغذية للأرومات الليفية الجنينية للفأر الطازجة. تتمثل الخطوة الأخيرة في انتقاء الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات يدويا من المزرعة ونقلها إلى ألواح خلايا مغذية جديدة للتوسع. في النهاية ، يمكن إظهار إعادة البرمجة الفعالة للمولويات متعددة القدرات PB إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات مع مورفولوجيا بشرية نموذجية عن طريق التألق المناعي وقياس التعبير الجيني.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن تنكس IPCs الخالية من الفيروسات من OTs المجمدة يقلل من التكلفة ووقت العمل والخطوات اليدوية للمشغلين أثناء معالجة العينات. ميزة أخرى لهذه التقنية هي أنها تسمح باستخدام OTs المجمدة المخزنة في بنك حيوي واسع النطاق تم جمعها من الدراسة السكانية كمادة مصدر لإنتاج IPS. ابدأ بجمع ثمانية ملليلتر من الدم المحيطي الوريدي في أنبوب بلاستيكي مخزن لسترات الصوديوم.

قم بتخزين الدم عند 25 درجة مئوية ومعالجته في غضون 12 ساعة. تتمثل خطوة المعالجة الأولى في الطرد المركزي للدم عند 2000 جي ثانية لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. استخدم دوار دلو متأرجح ولا تقم بتطبيق فرامل الطرد المركزي من الفصل.

اجمع المعطف الرقيق الغائم. هذه هي الطبقة بين مرحلة البلازما العلوية والمرحلة السفلية. الطبقة المصفرة هي جزء P-B-M-N-C المخصب الذي ينقل حوالي 500 ميكرولتر من كل عينة سعة ثمانية ملليلتر إلى أنبوب قارورة التبريد.

الآن يقوم Resus بتعليق الطبقة المصنوعة من الطبقة المصنوعة من الطبقة المصنوعة من الطبقة الكريمة عن طريق إضافة حجم متساو من وسط التجميد ، ثم قم بتجميد القارورة في حاوية تجميد ذات معدل متحكم فيه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع واحد. لتخزين أطول ، يمكن تخزين الخلايا في النيتروجين السائل لبدء الذوبان معلق مجمد بسعة ملليلتر واحد من PB MNCs تم الحصول عليها من معاطف بافيتي مجمدة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. ثم قم بتخفيف الخلايا إلى ملليلترين باستخدام PBS.

بعد ذلك ، انقل التخفيف إلى أنبوب سعة 50 مليلتر وأضف 10 ملليلتر من محلول تحلل الخلايا الحمراء. دع هذا الخليط يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بزيادة الحجم الإجمالي إلى 50 مل باستخدام PBS المعقم.

ثم قم بتدوير الخلايا عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران ، تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات ب 50 مل من PBS. الآن قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وأعد تعليقها في ملليلتر واحد من PBM و C المتوسط.

خذ حصة من الخلايا المعلقة وقم بقياس كثافة الخلية باستخدام غرفة العد. ثم اضبطه على 2 مليون خلية لكل مليلتر. الآن قم بإنشاء ثقافة التعليق.

قم بتحميل الخلايا في بئر من صفيحة 12 بئر قياسية واحتضانها لمدة 48 ساعة. قم بتغيير الوسائط كل يومين ، وشفط الخلايا باستخدام ماصة وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي الأنبوب المحمل عند 300 GS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من وسط P-B-M-N-C الطازج. من المعتاد تلوث خلايا الدم الحمراء خلال الأيام الأولى من ثقافة PB MNC. قبل إعادة الخلايا إلى خلايا جديدة ، تحقق منها جيدا تحت المجهر المقلوب عندما تكون عند حوالي 80٪ من الطلاقة المشتركة تقسم الثقافة أثناء النقل.

بعد أسبوعين من بدء ثقافة PB MNC ، يجب أن تكون الخلايا جاهزة للنقل. قم بإعداد أربعة بلازميدات ، أحدها يحمل T ثلاثة أربعة و S-H-R-N-A مقابل P 53 1 يحمل SOX الثاني و KLF أربعة يحمل LMIC و lin 28 وواحد يحمل EGFP. للبدء ، قم بجمع PB MNCs في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وحساب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام triam blue.

ثم قم بإعداد 2 مليون خلية قابلة للحياة ، وقم بالطرد المركزي لها وإعادة تعليق الخلايا في مزيج تعداء يحتوي على 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق T وميكروغرام واحد من كل من البلازميدات الأربعة. الآن املأ حاوية التعداء بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت إلكتروليتي. E اثنين ، قم بشفط مزيج التعداء في طرف 100 ميكرولتر وإخراج العينة عموديا في أنبوب التثقيب الكهربائي المجهز.

ثم أكلت الخلايا باستخدام ثلاث نبضات بعد التثقيب الكهربائي ، أعد تعليق الخلايا في ملليلترين من PBM قبل الحرب ووسط C مع 0.25 مللي مولار من زبدات الصوديوم. ثم احسب عدد الخلايا القابلة للحياة كما كان من قبل وانقل المعلق إلى بئر واحد من ستة آبار غير مطلي. اضبط اللوحة على الحضانة مع تحريك لطيف لمدة 24 ساعة.

الحفاظ على الخلايا المنقولة دون تقسيمها لمدة ثلاثة أيام من يوم التعدي في الأيام المعاكسة. استبدل الوسط بملليلترين من وسط P-B-M-N-C المحضر حديثا ب 0.25 مللي مولار من زبدات الصوديوم قبل يوم واحد من إنشاء الزراعة المشتركة ، وقم بإعداد الطبقة الأولى من MES ، وآبار صفيحة من ستة آبار مع ملليلتر واحد من مصفوفة الغشاء القاعدي واترك الألواح تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم استنشق مصفوفة الغشاء القاعدي ولوحة 200،000 MEFs في كل بئر مع ملليلترين من DMEM تحتوي على 10٪ FBS في اليوم التالي ، واجمع PB MNCs في طرف مليلتر واحد.

انقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بتدويرها. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من الوسط الطازج. ثم ضع الخلايا على الآبار المطلية بالميثامفيتامين واحتضن اللوحة بعد يومين.

استبدل الوسط بملليلترين من وسط IPSC ب 0.25 مللي مولار زبدات الصوديوم ، واستمر في استبدال وسائط IPSC كل يومين. بعد حوالي 22 إلى 25 يوما ، يجب أن تكون المستعمرات الأولى من I PSCs مرئية من 30 إلى 35 يوما. يجب أن تكون المستعمرات جاهزة للانتقاء وإعادة التشغيل في اليوم السابق لتعبئة خلايا تغذية الميثامفيتامين لمستعمرات IPSC على 12.

صفيحة جيدة في 125،000 خلية لكل بئر واحتضانها طوال الليل. في اليوم التالي ، استبدل الوسيط الموجود على خلايا الميثامفيتامين بمليلتر واحد من وسط IPSC التكميلي. ثم تحت مجهر تشريح ، استخدم إبرة لاختيار مستعمرة واحدة في كل مرة للمستعمرات الكبيرة التي تشكل كتل صغيرة.

انقلها بشكل فردي بواسطة الماصة ، وانقل مستعمرة واحدة إلى كل بئر من الصفيحة المطلية بالميثامفيتامين واحتضان اللوحة للمرور. تستخدم مستعمرات IPSC في البداية نفس تقنية الانتقاء ، ولكن بعد مقطعين أو ثلاثة مقاطع ، استخدم الإجراء القائم على الإنزيم ، تم توسيع PB MNCs المعزولة التي تظهر شكلا دائريا نموذجيا في وسط زراعة دم محدد لمدة 14 يوما ، ثم تم نقلها باستخدام البلازميدات العرضية بعد 10 إلى 15 يوما من التعدين. بدأت المستعمرات الصغيرة المستديرة الساطعة ذات الهوامش المحددة والتشكل الشبيه بالخلايا الجذعية الجنينية في الظهور بعد حوالي 20 إلى 30 يوما من التعدي.

ظهرت مستعمرات IPSC المدمجة للغاية ذات الحواف الحادة وزاد حجمها حتى أصبحت كبيرة بما يكفي للاختيار في خطوات التعبئة القليلة الأولى. حافظت مستعمرات IPSC على حالتها غير المتمايزة وأظهرت مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية النموذجية. يظهر التكبير المتزايد الخلايا الفردية داخل المستعمرات ونسبة النواة إلى السيتوبلازم العالية.

تم تمرير استنساخ IPSE المختار حوالي 10 إلى 15 مرة أخرى. تم تحليل حوالي 20 مرحلة فوقية من عدة ثقافات مستقلة من أجل الاستقرار الجيني. أظهرت جميع العينات جراما طبيعيا بعد خمسة إلى 10 توسعات في المختبر.

تميزت هذه المستنسخة بجذعتها وتعدد القدرات. كانت المستنسخة إيجابية لتلوين الفوسفاتيز القلوي. تحقق R-T-P-C-R الكمي من أن المستنسخة عبرت عن جينات متعددة القدرات داخلية عند مستويات أعلى بكثير من PB MNCs المبتدئة.

في حين أن مستويات CMIC الذاتية و KLA أربعة ظلت إلى حد ما نفس التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا العرضية الخارجية في IPCs ، مما يشير إلى التنشيط الناجح للجينات متعددة القدرات الذاتية. أخيرا ، كشف تحليل التألق المناعي أن IPCs عبرت عن علامات متعددة القدرات مثل OC three four SSEA four TRA 180 1 و SOX two و TRA one 60. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء IPCs من ko ، معزولة عن الدم المحيطي البشري بطريقة فعالة من حيث التكلفة ، واستخدام البلازميدات العرضية غير المتكاملة.