قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة في فيفو التعرض لجرعات منخفضة جدا من بيتا وغاما والأشعة السينية

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس تلف الحمض النووي وإصلاحه الناجم عن خلايا طحال الفأر عن طريق التعرض المزمن في الجسم الحي لجرعات منخفضة من إشعاع بيتا أو جاما. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض الفئران أولا لإشعاع بيتا الداخلي أو تشعيع جاما الخارجي لإحداث تغييرات محتملة في تلف الحمض النووي وإصلاحه. كخطوة ثانية ، يتم عزل خلايا PLE وتشعيعها بجرعة عالية من إشعاع جاما مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي الذي يمكن اكتشافه للسماح بمراقبة إصلاح الحمض النووي.

بمرور الوقت ، يتم بعد ذلك تمييز خلايا الطحال مناعية فلورية ضد جاما H two A x للسماح بقياس تلف الحمض النووي. في نهاية المطاف ، يمكن قياس تلف الحمض النووي الناتج عن جرعات إشعاع جاما الحاد التي تصل إلى 10 درجات مئوية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الحماية الراديوية ، مثل هل تزيد الجرعات المنخفضة من الإشعاع التي تتم مواجهتها عادة في بيئة مهنية أو طبية أو عامة من احتمالية حدوث آثار صحية ضارة مثل السرطان.

تتمثل المزايا الرئيسية لتقنيتنا على الطرق الحالية مثل عد بؤرة جاما H اثنين من A X باستخدام الفحص المجهري المناعي الفلوري في أن تقنيتنا تتطلب وقتا أقل بكثير للتحليل ، مما يجعلها مناسبة للدراسات على على نطاق واسع ، وتقلل من التحيز المتعلق بالمشغل في القياس الكمي ل gamma H two A X. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو إضفاء الطابع الشخصي على الطب والعلاج الإشعاعي للسرطان وأنه يمكن تحديد الحساسيات الإشعاعية الفردية للمريض باستخدام الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي لضبط نظام جرعة المريض من العلاج الإشعاعي. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة على سمية الإشعاع ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات أخرى مثل التحقيق في سمية الملوثات الكيميائية البيئية ، أو الآليات الأساسية لتكوين تلف الحمض النووي وإصلاحه في الفئران في الجسم الحي.

بالنسبة لإشعاع بيتا الداخلي ، عالج لمدة شهر واحد عن طريق الوصول إلى مياه التريتيوم لإشعاع جاما الخارجي. ضع قفص الفئران بالكامل على مسافة مناسبة من مصدر إشعاع جاما لتتناسب مع معدل جرعة التعرض للتريتيوم. ابدأ التعرض واستمر فيه لمدة شهر واحد.

استخدم مقاييس جرعات التلألؤ الحراري لقياس جرعات الامتصاص الإجمالية في نهاية التعرض. في يوم جمع الطحال ، ضع مصفاة خلوية داخل طبق بتري صغير فارغ لكل وأضف خمسة ملليلتر من وسط RPMI إلى كل طبق. بعد ذلك ، ضع الفأر القتل الرحيم في وضع الاستلقاء ورش الشعر بنسبة 70٪ من الإيثانول عندما ينقع بالكامل.

استخدم الملقط للإمساك بالجلد الأمامي لفتحة مجرى البول وعمل شق صغير في منطقة العجان من هذا الشق. قطع على طول خط الوسط البطني إلى تجويف الصدر ، مع الحرص على قطع الجلد فقط وليس جدار العضلات تحته. تشريح الجلد بعيدا عن خط الوسط.

ثم الإمساك بجدار البطن بالملقط. قطع على طول الوصول المتوسط للعضلات لفتح تجويف البطن. حدد موقع الطحال وامسكه برفق باستخدام ملقط معقم.

ثم اسحب الأنسجة برفق مع التخلص من النسيج الضام في نفس الوقت. قم بإزالة حوالي 10 من الطحال لإجراء تحليلات المصب. ثم انقل باقي الأنسجة إلى إحدى مصافي الخلايا لمدة تصل إلى ساعتين بعد حصاد كل الطحال.

استخدم ملقطا منحنيا معقما لفرم كل من الأنسجة داخل مصافي الخلايا الفردية. عندما يتم تجانس الطحال بشكل كاف ، قم بإزالة المصافي ونقل تعليق الخلية المفلترة إلى أنابيب سعة 15 ملليلترا. شطف كل من المصافي بخمسة ملليلتر إضافية من الوسط ، واسحب الغسالات مع بقية تعليق الخلية والطرد المركزي للخلايا مرتين Resus ، مع تعليق الكريات في 10 ملليلتر من RPMI الطازج كل بعد الدوران الأول.

بعد الدوران الثاني. أعد تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من RPMI ونقل أربعة ملليلتر من معلقات الخلية الناتجة إلى قوارير ثقافة أنسجة سعة 25 ملليلتر للحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع 80٪ رطوبة. نقل ما تبقى من معلقات الخلية إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مليلتر وخلايا طرد مركزي بأربع درجات مئوية.

باستخدام مضخة تفريغ ، قم بشفط المواد الطافية بعناية وأعد تعليق الكريات برفق في مليلتر واحد من المخزن المؤقت TBS وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى بعد تنظيف السوبينات بالمكنسة الكهربائية مرة أخرى. يعلق ريس الكريات في 300 ميكرولتر من TBS لكل منها. ثم أثناء الدوامة بسرعة منخفضة ، عند 700 ميكرولتر من 20 درجة مئوية تحت الصفر ، 100٪ إيثانول لكل أنبوب.

اقلب الأنابيب عدة مرات لمزيد من الخلط. ثم قم بتخزين العينات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى 12 شهرا. للحث على فواصل حبلا مزدوجة للحمض النووي لتحدي آلات الإصلاح.

ثقافة علم المشعير مع اثنين من رمادي من إشعاع جاما بمعدل جرعة يساوي أو أقل من 200 غرا صغير في الدقيقة. مباشرة بعد التحدي ، أعد الثقافة إلى حاضنة CO2. بعد ساعة واحدة ، انقل المزرعة المشعة إلى خزانة السلامة البيولوجية واستخدم ماصة لإعادة تعليق الخلايا برفق.

انقل ملليلتر واحد من معلق الخلية الناتج إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر على الجليد ، ثم قم بتدوير الخلايا. استخدم مضخة التفريغ لشفط السوبينات بعناية ثم قم بتعليق الكريات برفق في مليلتر واحد من TBS. ثم بعد غسل TBS ثان ، قم بإصلاح الخلايا في الإيثانول كما هو موضح للتو لتخزين 20 درجة مئوية تحت الصفر لتحليل الفلورسنت المناعي للخلايا.

أولا ، أضف 0.5 مل من TBS المثلج إلى أنابيب العينة المناسبة. الدوامة التالية aliquot Eloqua ، وهي ثابتة ناقص 20 درجة مئوية مخزنة صويتات SPL لمدة خمس ثوان. ثم انقل 0.5 مل من الخلايا إلى الأنابيب المناسبة وقم بتدويرها برفق ، وأعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من TBS المثلج الذي يحتوي على 1٪ FBS وخلايا الطرد المركزي.

مرة أخرى ، ثم احتضان العينات في مليلتر واحد من محلول TST لكل أنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة. بعد تدوير الخلايا ، مرة أخرى ، أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المضاد لجاما H ثنائي الفأس. ثم ضع الأنبوب على شاكر دوار بزاوية 45 إلى 60 درجة لمدة 1.5 ساعة عند 300 ضعف G ودرجة حرارة الغرفة في نهاية الحضانة.

اغسل العينات مرتين في مليلتر واحد من TBS المثلج البارد الذي يحتوي على 2٪ FBS. ثم أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المحضر حديثا على منصة الاهتزاز. بعد ساعة واحدة ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من الثلج يسمى TBS ، يحتوي على 1٪ FBS متبوعا بغسل في مليلتر واحد من الثلج يسمى TBS وحده.

أخيرا ، أعد تعليق الكريات في 0.5 مل من TBS التي تحتوي على يوديد البروبيديوم في هذه الرسوم البيانية ، تظهر نتائج التدفق الخلوي التمثيلية تم بوابات الخلايا لأول مرة بناء على جانب حجمها الإلكتروني. أكد تلطيخ اليود البروبيديوم المبعثر أن كلا من عينات التحكم والتحدي الإشعاعي أظهرت توزيعا طبيعيا لدورة الخلية. في حين أن قياس إشارة جاما H ثنائية المحور أظهر زيادة أكبر من ضعفين في كسر حبلا الحمض النووي المزدوج داخل الخليتين المشعتين الرماديتين مقارنة بالضوابط غير المعالجة هنا ، فإن مستويات جاما H النسبية اثنين من AX في خلايا الفأر ، بعد ساعة واحدة من التعرض خارج الجسم الحي لجرعات منخفضة أو عالية من إشعاع جاما كما هو متوقع.

تم الكشف عن تحريض قوي ثلاثي الأضعاف لفواصل الخيوط المزدوجة بعد التحدي الرمادي. لوحظت زيادة طفيفة ولكنها ذات دلالة إحصائية بعد التعرض ل 0.1 رمادي مما يشير إلى حساسية كافية للطريقة. يشير نمط التألق الشبيه بالبؤر الملحوظ الذي لوحظ بواسطة الفحص المجهري إلى أن الإشارة تنشأ من فواصل الخيط المزدوج للحمض النووي الفردي داخل كروماتين CH للتحقق من صحة خصوصية التلوين.

هنا ، يتم عرض مستوى فواصل الخيوط المزدوجة للحمض النووي التي تظهرها خلايا PLE التي تم حصادها من الفئران المعرضة لشهر واحد من الماء المترثب. على الرغم من أن العلاج أدى إلى زيادة بنسبة 10٪ في مستوى جاما القاعدية H اثنين A X ، إلا أن التغيير لم يكن ذا دلالة إحصائية. علاوة على ذلك ، لا توجد فروق في التكوين المقاس وفقدان جاما H اثنين من الفأس.

بعد التحدي الذي يمثل حركية الحمض النووي ، لوحظ إصلاح الفرامل ذات الخيوط المزدوجة بين الخلايا من الفئران المعالجة بالماء والسيطرة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الالتزام بالقواعد واللوائح التي وضعتها جمعية الحماية من الإشعاع المحلية واستخدام مختبر أو منشأة معتمدة حيث يمكن تنفيذ مشاريع الفئران على نطاق واسع باستخدام مصادر الإشعاع الداخلية والخارجية. بمجرد إتقانها ، لا تتطلب هذه التقنيات سوى حوالي يوم ونصف لكل 10 فئران لإكمالها إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تحليل قياس التدفق الخلوي لتعبير Gamma H two A X لقياس فواصل حبلا الحمض النووي المزدوج وإصلاحه في الجسم الحي عن طريق التعرض لجرعات منخفضة من إشعاع التريتيوم أو جاما. بالإضافة إلى هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل M FISH في الخلايا الليمفاوية في الدم ، ومقايسة النواة الدقيقة لنخاع العظم و R-T-Q-P-C-R لقياس التعبير عن جينات الاستجابة للإجهاد لتقييم المخاطر الصحية المرتبطة بالتعرض لجرعة منخفضة من الإشعاع.