التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور الترتيب والتمدد بين الخلايا الغضروفية من خلال تحليل الخلايا النسيلة لقوس الحمار الوحشي. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء خط SOX 10 ERT two Cree zebra bow M لتحقيق إعادة تركيب خاصة بالأنسجة في غضروف الوجه القحفي والأجنة لتحليل النسيل. بعد ذلك ، يتم نبض الأجنة بتاموكسيفين في 10 ، لذلك مرحلة العث لمدة ثلاث ساعات من أجل تحفيز عملية إعادة التركيب.

ثم يتم اختيار الأجنة للتعبير عن نشاط CRE وتعبير الفلورسنت الأحمر القوي أو RFP ، ويتم تركيب الأجنة لتصوير الغضروف القحفي الوجهي C. تظهر النتائج تحليل الخلايا متعددة الأطياف للخلايا الغضروفية في الوجه القحفي بناء على التصوير متحد البؤر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل S في التلوين الأزرق أو الخطوط المعدلة وراثيا مثل so و GFP أو SOX و kde ، هي أن قوس الحمار الوحشي يسمح لنا بمراقبة ومتابعة مجموعات الخلايا النسيلة المشاركة في تكوين الأعضاء على وجه التحديد.

للتحضير لجمع الأجنة في اليوم الأول ، قم بإعداد عدة أزواج من الذكور والإناث من أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا من السوكس ، 10 ERT اثنين من أسماك الحمار الوحشي Cree bow M في أحواض تزاوج مقسمة بين الساعة الخامسة و 6:00 مساء في اليوم التالي بعد التحقق تحت المجهر الضوئي من أن الأجنة قد وصلت إلى مرحلة 10 سيلوليت تحت مجهر فلوري باستخدام مرشح RFP. اعزل الأجنة الحمراء الزاهية وانقلها إلى طبق بتري جديد مع E ثلاثة متوسطة طازجة للحث على إعادة تركيب كري. أضف 10 محلول ميكرومولار هيدروكسي تاموكسيفين إلى طبق بتري واحتضان الأجنة عند 28.5 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

ثم صب محلول تاموكسيفين في حاوية نفايات بيولوجية واستخدم E ثلاثة لغسل الأجنة عدة مرات بعد احتضان الأجنة طوال الليل إلى 28 إلى 29 ، لذا في مرحلة العث ، انقل الأجنة إلى محلول E ثلاثة PTU وإعادتها إلى الحاضنة. لتصور الهياكل القحفية الوجهية C المطورة بالكامل ، حدد الأجنة بأربعة DPF بإشارة حمراء مكثفة وتعبير كري أصفر في شبكية العين. بعد تخدير الجنين في تريكا ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بنقله إلى طبق بتري يحتوي على قطرة من ميثيل السليلوز على شريحة متحدة البؤر نظيفة.

ضع قطرة من ميثيل السليلوز الطازج واستخدم طرف لودر صغير لتركيب الجنين في وضعه ظهريا مع الحرص على عدم لمسه مباشرة بزلة غطاء 25 × 25. قم بتغطية الجنين واستخدم زلة الغطاء لمعالجة الجنين إذا لزم الأمر. لتصوير الجنين، استخدم هدف عدسة جافة 20 ×.

للتركيز على الموضوع، اضغط على الزر L 100 على المجهر، ثم حدد زر الإعداد متحد البؤر. انقر فوق تلقائي وحدد CFP للقناة الأولى GFP للقناة الثانية و RFP أو M cherry للقناة الثالثة. ثم أغلق النافذة.

قم بتشغيل القناتين الثانية والثالثة قبل النقر فوق زر إزالة التعشيق. ثم انقر فوق تشغيل لبدء المسح. بعد ضبط الإعدادات ، التقط الصور المطلوبة واحفظها بتنسيق البرنامج متحد البؤر وكذلك بتنسيق TIF لمعالجة الصور حسب القناة.

لإجراء تصوير CFP، قم بإيقاف تشغيل القناتين الثانية والثالثة وتشغيل القناة الأولى دون تغيير منطقة التركيز البؤري. أعد ضبط إعدادات المسح الضوئي قبل التقاط الصور ، واحفظ الصور كما هو موضح للتو ، وقم بإجراء معالجة الصور كما هو موضح من قبل PAN والزملاء كما هو موضح هنا. كان تصور الغضروف التقليدي من خلال تلطيخ جبل سيان الأزرق بالكامل لا يقدر بثمن في مراقبة غضروف الميكيل النامي ويستخدم بشكل شائع لتصور التنظيم الخلوي النهائي لتحليل الخلايا الغضروفية النامية بمرور الوقت في تتبع النسب.

تم استخدام الخطوط المعدلة وراثيا SOX 10 kda لدراسة هجرة الخلايا والتقارب والتمدد في الأجنة الحية باستخدام التصوير الحي للخط المعدل وراثيا لقوس الحمار الوحشي. لمزيد من الدراسة ، يكشف تنظيم الخلايا الغضروفية في الهيكل العظمي القحفي الوجهي C عن عملية التجميع والتطالة بين الخلايا الغضروفية التي تتوسط في امتداد ونمو غضروف ميكل. يوضح هذا الشكل الفك السفلي من قوس الحمار الوحشي UI M Sox 10 ERT اثنين من الأجنة المعدلة وراثيا من Cree بين 3D PF وخمسة أيام بعد الإخصاب.

من الأفضل تصوير الفك السفلي بطنيا للسماح برؤية واضحة لتنظيم الخلايا في غضروف المليس كما هو موضح هنا. تسمح الألوان الموروثة التي يتم الحفاظ عليها بثبات بتتبع النسب بسهولة ورسم خرائط لمصير خلية القمة العصبية في الجمجمة. يبدو أن الخلية الزرقاء المفردة تهاجر وتستوعب الخلايا المجاورة لها ، ثم تستطيل على طول المحور الخلفي الأمامي لتشكيل موقع chondra بشكل موحد الشكل ، وبالتالي الحفاظ على الشكل العالمي لغضروف meles أثناء امتداده إلى الأمام.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحث في مجال تنمية القطط لفحص الكوندرو في تكوين الهيكل العظمي لأسماك الزرد.