التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور تداخل واستطالة الخلايا الغضروفية عبر تحليل الخلايا النسلية بتقنية zebra bow. ويتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء خط مجهزي zebra bow M باستخدام SOX 10 ERT two Cree لتحقيق إعادة تركيب محددة للأنسجة في الغضروف القحفي الوجهي وفي الأجنة من أجل التحليل النسلي. بعد ذلك، يتم تعريض الأجنة لنبضة من التاموكسيفين في مرحلة 10-somite لمدة ثلاث ساعات لتحفيز عملية إعادة التركيب.

بعد ذلك، يتم اختيار الأجنة التي تُظهر نشاط CRE وتعبيرًا قويًا للفلورة الحمراء أو RFP، ثم تُثبّت الأجنة لتصوير الغضاريف القحفية الوجهية C. وتُظهر النتائج تحليلاً خلويًا متعدد الأطياف للخلايا الغضروفية القحفية الوجهية بناءً على التصوير المجهري البؤري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل صبغ S باللون الأزرق أو السلالات المعدلة وراثياً مثل so و GFP أو SOX و kde، في أن zebra bow تتيح لنا مراقبة وتتبع المجموعات الخلوية النسلية المشاركة في تكوين العضو بشكل محدد.

للتحضير لجمع الأجنة في اليوم الأول، يتم وضع عدة أزواج من ذكور وإناث أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً sox, 10 ERT two Cree zebra bow M في أحواض تزاوج مقسمة بين الساعة الخامسة والسادسة مساءً. وفي اليوم التالي، وبعد التحقق باستخدام مجهر ضوئي من وصول الأجنة إلى مرحلة 10 cellulite، يتم فحصها تحت مجهر فلوري باستخدام مرشح RFP. تُعزل الأجنة ذات اللون الأحمر الساطع وتُنقل إلى أطباق بتري جديدة تحتوي على وسط E3 طازج لتحفيز إعادة تركيب Cree. يُضاف محلول hydroxy tamoxifen بتركيز 10 micromolar إلى طبق بتري، وتُحضن الأجنة عند درجة حرارة 28.5 °C لمدة ثلاث ساعات.

بعد ذلك، قم بسكب محلول Tamoxifen في حاوية النفايات البيولوجية، واستخدم محلول E three لغسل الأجنة عدة مرات. بعد تحضين الأجنة طوال الليل حتى وصولها إلى مرحلة 28 إلى 29 somite، انقل الأجنة إلى محلول E three PTU وأعدها إلى المحضنة. ولتصوير الهياكل القحفية الوجهية المكتملة النمو، اختر الأجنة في عمر 4 DPF التي تظهر إشارة حمراء مكثفة وتعبير yellow Cree في الشبكية. بعد تخدير الجنين باستخدام Trica، وفقاً للبروتوكول المذكور، انقله إلى أطباق Petri تحتوي على قطرة من Methylcellulose على شريحة confocal نظيفة.

ضع قطرة من مادة Methylcellulose الطازجة واستخدم طرف شاحن مجهري لتثبيت الجنين في وضع ظهري، مع الحرص على عدم لمسه مباشرة، باستخدام شريحة غطاء قياس 25 في 25. قم بتغطية الجنين واستخدم شريحة الغطاء لتحريك الجنين إذا لزم الأمر. ولتصوير الجنين، استخدم عدسة شيئية جافة بقوة 20 x.

للتركيز على العينة، اضغط على زر L 100 في المجهر، ثم اختر زر إعدادات المجهر البؤري (confocal setup). انقر على التلقائي (auto) واختر CFP للقناة الأولى و GFP للقناة الثانية و RFP أو M cherry للقناة الثالثة. ثم أغلق النافذة.

قم بتشغيل القناتين الثانية والثالثة قبل النقر على زر إزالة التعشيق (remove interlock). ثم انقر على زر التشغيل (play) لبدء المسح. بعد ضبط الإعدادات، قم بالتقاط الصور المطلوبة واحفظها بتنسيق برنامج المجهر متحد البؤرة (confocal software format) وكذلك بتنسيق TIF لمعالجة الصور حسب القناة.

لإجراء تصوير CFP، قم بإيقاف تشغيل القناتين الثانية والثالثة وتشغيل القناة الأولى دون تغيير منطقة التركيز. أعد ضبط إعدادات المسح قبل التقاط الصور، واحفظ الصور كما وصفنا سابقاً، ثم قم بمعالجة الصور وفقاً لما وصفه بان وزملاؤه كما هو موضح هنا. لقد كانت الطريقة التقليدية لتصوير الغضروف عن طريق صبغ Alcian blue للعينة الكاملة لا تقدر بثمن في مراقبة غضروف ميكل النامي، وتُستخدم عادةً لتصور التنظيم الخلوي النهائي لمزيد من التحليل للخلايا الغضروفية النامية بمرور الوقت عبر تتبع السلالة.

استُخدمت السلالات المعدلة وراثياً لبروتين SOX 10 kda لدراسة هجرة الخلايا والتقارب والامتداد في الأجنة الحية باستخدام التصوير الحي للسلالة المعدلة وراثياً zebra bow m. ولإجراء مزيد من الدراسة حول تنظيم الخلايا الغضروفية في البنية الهيكلية للوجه والجمجمة C، يتبين أنها تكشف عن عملية تداخل الخلايا الغضروفية واستطالتها التي تتوسط امتداد ونمو غضروف ميكل. يوضح هذا الشكل الفك السفلي من أجنة zebra bow M Sox 10 ERT two Cree المعدلة وراثياً في الفترة ما بين 3D PF و5 أيام بعد الإخصاب.

يُفضل تصوير الفك السفلي من الناحية البطنية لإتاحة رؤية واضحة لتنظيم الخلايا في غضروف ميس (meles cartilage) كما هو موضح هنا. وتسمح الألوان المستقرة والموروثة بتتبع السلالات ورسم خرائط مصير خلايا العرف العصبي القحفية بسهولة. تظهر الخلية الزرقاء الوحيدة وهي تهاجر وتتداخل مع الخلايا المجاورة لها، ثم تستطيل على طول المحور الأمامي الخلفي لتشكل موقع غضروفي منتظم الشكل، مما يحافظ على الشكل العام لغضروف ميس أثناء امتداده نحو الأمام.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تطور الغضاريف لفحص الخلايا الغضروفية في تكوين الهيكل العظمي لسمك الزيبرا.