مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الإعجاب بالمستقبلات والارتباط في نفس الوقت ومراقبة إشارات الكالسيوم المستحثة عن الارتباط على خلية واحدة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل البيوتين أولا وضبط الأسمولية لخلايا الدم الحمراء البشرية أو كرات الدم الحمراء لاستخدامها كمحول قوة شديد الحساسية. الخطوة الثانية هي تشغيل الخرز الزجاجي المجهري ، والذي يشمل التنظيف والتمدد وطلاء الترابط.

بعد ذلك ، يتم عزل الخلايا التائية واحتضانها بصبغة الكالسيوم أقل من الساعة 2:00 صباحا ، مما يتيح مراقبة تركيز أيونات الكالسيوم داخل الخلايا. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحضير الماصات الدقيقة في غرفة التجربة المطلوبة بشكل خاص لإعداد التجربة. في النهاية ، يتم استخدام مسبار قوة الغشاء الحيوي الفلوري أو تقنية BFP لإظهار التصاق الخلية بحرزة مطلية بالترابط ، وقياس حركية ربط ترابط المستقبل ، وفي الوقت نفسه مراقبة مستوى الكالسيوم داخل الخلايا.

هذه التقنية مفيدة في فهم كيفية استشعار القوة الميكانيكية بواسطة الخلايا التائية عن طريق التعرف على الأندروجين. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية في أن FBIP يمكنه قياس حركية ربط الترابط للمستقبلات والإشارات داخل الخلايا في وقت واحد. تشمل الأجزاء الصعبة من هذا البروتوكول إنتاج مسارات بيب صغيرة يدويا بأقطار صحيحة, التقاط الخلايا والنحل مع PEPs الصغيرة وتجميع مسبار القوة, والتي يمكن أن تفشل في البداية, على الرغم من أنه لا يمكن أن يكون هنا لعرض هذا الفيديو.

ساهم المؤلف المشارك أرنولد جي ، الذي أكمل مؤخرا درجة الدكتوراه في مختبري ، بشكل كبير في التحقق من صحة التصنيع الأولي لبروتوكول FBAP. احصل على ثمانية إلى 10 ميكرولترات من الدم من وخز الإصبع وأضفها إلى مليلتر واحد من بيكربونات الكربونات ، أو دوامة ترك النفاثة العازلة أو الماصة الخليط وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 900 جم ، وتخلص من المادة الطافية قبل إجراء عازلة بيكربونات الكربونات. اغسل مرة أخرى.

بعد ذلك ، امزج 10 ميكرولترات من عبوة كرات الدم الحمراء الناتجة 171 ميكرولترا من عازلة بيكربونات الكربونات ، و 1049 ميكرولتر من البيوتين. حل رابط PEG NHS واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. باستخدام نفس إجراءات الغسيل قبل غسل خليط كرات الدم الحمراء الناتج مرة واحدة باستخدام مخزن بيكربونات الكربونات ، ثم مرتين باستخدام N اثنين 5٪ عازلة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف Nystatin إلى N اثنين من المخزن المؤقت بنسبة 5٪. لعمل تركيز نهائي يبلغ 40 ميكرولتر لكل مليلتر ، امزج خمسة ميكرولترات من كرات الدم الحمراء الحيوية مع 71.4 ميكرولتر من محلول النيستاتين واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند صفر درجة مئوية. أخيرا، اغسل العينات مرتين باستخدام N اثنين 5٪ عازلة وقم بتخزين كرات الدم الحمراء الحيوية مع N اثنين 5٪ buffer بالإضافة إلى 0.5٪ BSA في الثلاجة قم بتركيب قطعة واحدة من الماصة الصغيرة مقاس 3 بوصات على مجتذب الماصة الصغيرة.

انقر فوق زر السحب بحيث يتم تسخين منتصف الشعيرات الدموية بواسطة الماكينة وسيتم سحب الشعيرات الدموية على الطرفين لعمل شعيرات دموية بأطراف حادة ، وهما الماصات الخام. بعد ذلك، قم بتركيب ماصة خام على حامل الماصة الصغيرة لتسخين الماصة الصغيرة لإذابة الكرة الزجاجية على الحدادة. أدخل طرف الماصة الخام داخل الكرة الزجاجية.

قم بتبريد الكرة الزجاجية واسحب الماصة الخام لكسرها من الخارج ، مع ترك طرفها داخل الكرة. كرر هذا الإجراء حتى يتم الحصول على فتحة الطرف المطلوبة لبناء غرفة الخلية المقطوعة أولا إلى 40 ملم × 22 ملم × 0.2 ملم انزلاق غطاء باستخدام قاطع زجاجي إلى قطعتين مقاس 40 ملم × 11 ملم × 0.2 ملليمتر. تم بناء حجرة الخلية على أساس حامل غرفة محلي الصنع يتكون من قطعتين من المربعات المعدنية ومقبض يربطهما ببعضهما البعض.

باستخدام غراء النعمة ، ينزلق غطاء واحد إلى الجانب السفلي من حامل الغرفة بطريقة تربط بين المربعين المعدنيين. وبالمثل ، قم بلصق زلة الغطاء الأخرى على الجانب العلوي ، والتي ستشكل غرفة خلية انزلاق غطاء متوازية. بعد ذلك، استخدم الماصة لحقن 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت التجريبي بين زلات الغطاء.

تأكد من توصيل المخزن المؤقت بكلتا زلات الغطاء. قم بتدوير الغرفة ورجها برفق للسماح للمخزن المؤقت بلمس طرفي الغرفة. ثم قم بحقن الزيت المعدني بعناية في جانبي الغرفة ، مع إحاطة المنطقة العازلة التجريبية ، وبالتالي إغلاق المخزن المؤقت من الهواء الطلق.

حقن تعليق prob. الخرز هي bcs وأهداف في المناطق العلوية والوسطى والسفلية من المنطقة العازلة على التوالي. لبدء تجربة BFP ، قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء.

ضع الغرفة على مرحلة المجهر الرئيسية. الخطوة التالية هي تركيب جميع الماصات الدقيقة الثلاثة لجهاز BFP. المسبار على اليسار هو الاستيلاء على كرات الدم الحمراء.

الهدف على اليمين هو الاستيلاء على الخلية ويعمل المساعد الموجود في أسفل اليمين على الاستيلاء على حبة لتثبيتها ، واستخدام حاقن صغير لردم ماصة صغيرة بمخزن مؤقت تجريبي. انزع الماصة الدقيقة من حامل الماصة واحتفظ بها في مكان منخفض للسماح للسائل بالتنقيط من الطرف. أدخل الماصة الدقيقة بسرعة في طرف الحامل، مع التأكد من عدم دخول فقاعة الهواء إلى الماصة الدقيقة.

أثناء الإدخال، أحكم ربط برغي الحامل، ثم قم بتركيب كل حامل ماصة على المعالج الدقيق المقابل له. ادفع الماصة الدقيقة باتجاه الغرفة بحيث تدخل أطرافها إلى منطقة الغرفة العازلة. اضبط موضع الماصة الدقيقة وابحث عنها تحت مجال رؤية المجهر.

تحرك حول مرحلة حامل الغرفة للعثور على مستعمرات العناصر الثلاثة. اضبط موضع الماصة الدقيقة المقابلة واحدا تلو الآخر عن طريق تدوير مقابض المعالجات للسماح لطرف الماصة الدقيقة بالاقتراب من خلية واحدة أو حبة واحدة أو شفط الخلية أو الخرزة. من خلال ضبط الضغط داخل الماصة الدقيقة المقابلة، ستلتقط جميع الماصات الصغيرة الثلاث العناصر المقابلة لها.

تحرك حول مرحلة حامل الغرفة للعثور على مساحة مفتوحة بعيدا عن مستعمرات العناصر المحقونة حيث سيتم إجراء التجربة. قم بتبديل الوضع المرئي للمجهر لتصور الصورة على برنامج الكمبيوتر. انقل العناصر الثلاثة الموجودة على أطراف الماصة إلى مجال رؤية البرنامج.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة حبة المسبار و RBC وقم بمناورة حبة المسبار بعناية إلى قمة كرات الدم الحمراء. الآن اصطدم الخرزة لفترة وجيزة بكرات الدم الحمراء واتراجعها برفق ، واضبط ضغط الماصة الدقيقة المساعدة لتفجير الخرزة برفق بعيدا بحيث تترك ملتصقة بقمة كرات الدم الحمروية. حرك الماصة المساعدة بعيدا وقم بمحاذاة الهدف وحبة الاختبار على البرنامج.

في نافذة مجال الرؤية، استخدم أدوات البرنامج لقياس أنصاف أقطار الماصة الدقيقة للمسبار وكرات الدم الحمراء ومنطقة التلامس الدائرية بين كرات الدم الحمراء وحبة المسبار. تسمح هذه القيم بتقدير ثابت الربيع لكرات الدم الحمراء بواسطة المعادلة المدرجة في بروتوكول النص. بعد إدخال ثابت زنبرك RBC المطلوب في البرنامج ، ارسم خطا أفقيا عبر قمة كرات الدم الحمراء ، مما سينتج عنه منحنى في النافذة المجاورة يشير إلى سطوع كل بكسل.

على طول هذا الخط ، اسحب خط العتبة ليكون عند نصف عمق المنحنى تقريبا. بعد ذلك ، حدد وضع التجربة المطلوب ، أو مقايسة تردد التصاق مقايسة التذبذب الحراري ، أو مقايسة مشبك القوة. قم بتعيين المعلمات حسب الرغبة.

انقر فوق ابدأ ، والذي يسمح للبرنامج بتحريك الماصة المستهدفة ودفع الهدف داخل وخارج الاتصال بالمسبار ، سيتم إجراء جمع البيانات وبالتوازي ، والذي يسجل موضع الخرزة الاحترافية في الوقت الفعلي. أوقف البرنامج بالنقر فوق الزر إيقاف التجربة التي ستظهر فيها نافذة. للسماح بحفظ البيانات المكتسبة لاستخدام وظيفة التألق لنظام BFP ، قم بتشغيل مصدر ضوء الإثارة والكاميرا الفلورية ، والتي يتم التحكم فيها بواسطة برنامج منفصل.

ثم حدد معلمات التصوير الفلوري ، بما في ذلك قنوات التعرض والإثارة والاكتساب. اتبع جميع الاستعدادات في بروتوكول تجربة BFP ، بما في ذلك محاذاة المسبار والهدف للسماح بتصور صورة الفلورسنت الحية للخلية المستهدفة التي يتم إثارتها بواسطة ضوء الإثارة 340 نانومتر أو 380 نانومتر. استخدم أداة التقسيم لتقسيم المنطقة التي ستبقى فيها الخلية تقريبا خلال فترة التسجيل بأكملها.

بعد ذلك ، انقر في نفس الوقت على التسجيل وابدأ في النقر. يسمح السجل لضوء 340 نانومتر و 380 نانومتر بإثارة قالب التألق داخل الخلايا بالتناوب. سيتم تسجيل زوج من الصور الفلورية المقابلة بالتناوب حوالي واحدة كل ثانية.

يؤدي النقر فوق البداية إلى بدء تجربة BFP لتحليل التفاعل الجزيئي وتجربة التصوير الفلوري لمراقبة إشارات الكالسيوم داخل الخلايا ، والمضي قدما في تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. في منحنيات البيانات الأولية للقوة الزمنية ، يتم اشتقاق القوة من تتبع تغيير موضع الخرزة الاحترافية. في حالة عدم الالتصاق ، ستعود القوة إلى الصفر في إشارة الوقت العكسي للقوة بعد سحب الخلية المستهدفة من سطح الخرزة.

على العكس من ذلك ، في حدث قوة التمزق ، سيتجلى الالتصاق من خلال ارتفاع سريع للقوة إلى مستوى إيجابي أثناء التراجع ، متبوعا بانخفاض سريع إلى الصفر. في حدث العمر ، سيتم تثبيت القوة الإيجابية لتحقيق هضبة. طول الهضبة هو العمر.

من خلال إجراء دورات تجربة VFP المتكررة ، سيتم اشتقاق منحنى القوة مقابل الوقت. تظهر هنا صور الفلورسنت لعدد قليل أو اثنين من الخلايا التائية المحملة عند الإثارة بقنوات ضوئية 340 نانومتر و 380 نانومتر. تظهر كلتا الصورتين ملامح واضحة للخلية ، مما يشير إلى أن الخلية كانت ملطخة جيدا بعد اشتقاق بيانات حركية الربط وبيانات التألق من خلية T ، يتم تقديم كل من منحنى العمر التراكمي ومنحنى مستوى الكالسيوم في نفس الشكل لإيجاد العلاقة بينهما.

الآن يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة A-F-B-I-P. أثناء هذا الإجراء. من المهم أن تتذكر التحقق مما إذا كان هناك أي عيب في مسبار القوة ، مثل قطر الماصة الدقيقة ، وطول إسقاط الخلية المطاطية ، وموضع الخرزة.

كل هذا سيؤثر على دقة قياس القوة. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الميكانيكية الجزيئية لدراسة آلية التنبيغ الميكانيكي في جميع الأنظمة البيولوجية الممكنة.