نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الحساسية الكيميائية لخلايا المايلوما المتعددة الأولية تجاه مجموعة من العوامل العلاجية الكيميائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق خلط خلايا المايلوما المتعددة المعزولة من نضح نخاع العظم الحديث مع سدى مشتق من المريض تم استزراعه مسبقاً وكولاجين. وفي الخطوة الثانية، يتم استزراع خليط الـ CEL في طبق متعدد الآبار.

تُعالج الخلايا بعد ذلك بالعوامل الكيميائية العلاجية المراد دراستها، ثم تُنقل اللوحة إلى الحاضنة الخاصة بمجهر ذي منصة آلية لإجراء تصوير متسلسل للخلايا على مدار فترة حضانة تبلغ 96 hour. وفي النهاية، يمكن استخدام خوارزمية لتحليل الصور الرقمية لإنشاء منحنيات الحيوية لكل عقار وتركيز. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بمقاييس الحيوية النهائية الموجودة في إمكانية استخدامها لاختبار عدة عوامل كيميائية علاجية مقابل عينة مريض واحدة، وبإمكانية قياس حيوية خلايا المريض طوليًا على مدار عدة أيام دون الحاجة إلى فصل الخلايا عن السدى أو المصفوفة.

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج الأورام المكونة للدم، حيث يمكن استخدامها نظرياً للتنبؤ بالاستجابة السريرية لأنظمة علاج كيميائي محددة. لقد خطرت لنا فكرة هذا البروتوكول عندما أدركنا أن استبدال شرائح الموائع الدقيقة الأصلية بأطباق متعددة الآبار من شأنه أن يقلل بشكل كبير من التكلفة والوقت اللازمين لإتمام التجربة. لتحضير المزارع المشتركة من خلايا المايلوما المتعددة الأولية والخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من نخاع العظم باستخدام ماصة متعددة القنوات، ابدأ بتعليق الخلايا بستة أضعاف التركيز النهائي في RPMI 1640.

بعد ذلك، اخلط 50 µL من كل نوع من الخلايا مع كولاجين من النوع الأول مُحضّر حديثاً حتى يصل الحجم النهائي إلى 300 µL. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 8 µL يدوياً من مزيج مصفوفة الخلايا في مركز كل بئر من آبار طبق يحتوي على 384 بئراً، وقم بطرد مركزي للطبق لتركيز جميع الخلايا في نفس المستوى البؤري.

بعد الطرد المركزي، تُحضن الأطباق في ظروف زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة للسماح للبلمرة بالحدوث للهلام. ثم يُضاف 80 µL من وسط النمو المُدعم إلى كل بئر، وتُحضن الطبقة طوال الليل للسماح للسدى بالالتصاق بقاع الطبق. لتحضير المزارع المشتركة لسدى المايلوما المتعددة باستخدام ماصة آلية، ابدأ بتعليق 300 µL من خلايا المايلوما المتعددة الموجبة لـ CD 1 38 و300 µL من الخلايا السدوية في وسط RPMI 1640، بكثافة تعادل ست مرات الكثافة النهائية المطلوبة كما تم توضيحه للتو.

بعد ذلك، اخلط كلا نوعي الخلايا معاً في أنبوب سعة 1.5 milliliter يحمل ملصق CD 1 38 positive وضع الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا. بعد ذلك، قم بتعليق 60 microliters من خط خلايا المايلوما المتعددة المناسب و 60 microliters من الخلايا السدوية في وسط RPMI 1640 بكثافة تعادل ستة أضعاف الكثافة النهائية المطلوبة، واخلط كلا نوعي الخلايا معاً في أنبوب سعة 1.5 milliliter يحمل ملصق cell line، ويتم تحضينه أيضاً عند 37 °C. قم بتحميل ملف نص استزراع الخلايا على الماصة الآلية.

ثم ضع صندوق رؤوس ماصات سعة 200 µL في المحطة A، وصفيحة معايرة دقيقة في المحطة B، وصفيحة معقمة ذات 84 بئراً في المحطة E من الروبوت. بعد ذلك، اخلط خليط الخلايا الموجبة CD 1 38 مع أنبوب الوسط المختلط مسبقاً CD 1 38 المحضر حديثاً، وانقل 1.5 mL من محلول الخلايا الناتج إلى البئر رقم 1 في صفيحة المعايرة الدقيقة.

ضع بقية الخلايا على الثلج وابدأ البرنامج. سيقوم الروبوت بتوزيع الخلايا في أول 176 بئراً من الطبق ذي 384 بئراً ثم سيتوقف مؤقتاً. استغل هذا الوقت لنقل بقية الخلايا الموجبة لـ CD 1 38 إلى البئر رقم اثنين من طبق المعايرة الدقيقة (microtiter plate) ثم استأنف البرنامج.

سيتعرف الروبوت على الـ 144 بئراً المتبقية من اللوحة ويتوقف مرة أخرى. الآن، اخلط الخلايا من أنبوبة الخط الخلوي مع أنبوبة من المزيج المسبق للخط الخلوي المُحضّر حديثاً، وانقل المحتويات إلى البئر رقم ثلاثة من لوحة المعايرة الدقيقة. بعد ذلك، استأنف البرنامج مجدداً، مما يسمح للروبوت بزرع الخلايا في الـ 64 بئراً المتبقية من لوحة الـ 3 84 بئراً.

بمجرد الانتهاء من استزراع البئر الأخير، قم بطرد الخلايا نحو الأسفل باستخدام جهاز الطرد المركزي وانقل المزارع المشتركة إلى حاضنة زراعة الخلايا لبلمرة الكولاجين. بعد مرور ساعة واحدة، قم بتحميل نص برمجة طبقة الوسط على الروبوت، وضع صندوق رؤوس ماصات سعة 120 microliter في المحطة A، وخزان كواشف يحتوي على 31 milliliters من وسط RPMI 1640 المكمل بمصل جنين البقر وبلازما المريض والمضادات الحيوية في المحطة B، ولوحة CED 3 ذات 84 بئرًا في المحطة E. ثم قم بتشغيل البرنامج؛ حيث سيقوم الروبوت بنقل 81 microliters من الوسط المكمل إلى كل بئر.

عندما ينتهي الروبوت من عمله، أعد الخلايا إلى الحاضنة للسماح للسدى بالالتصاق بالركيزة طوال الليل. ولمعالجة الخلايا المزروعة بالعقار المطلوب، قم أولاً بتحميل نص "drug plate script" لطبقة الوسط في واجهة مستخدم الماصة الروبوتية. ثم ضع صندوق رؤوس ماصات سعة 120 microliter في المحطة A، وخزاناً يحتوي على 21 milliliters من وسط RPMI 1640 المكمل ببلازما مريض FPS والمضادات الحيوية في المحطة B، وصفيحة 3 84 well فارغة في المحطة E، ثم قم بتشغيل البرنامج؛ حيث ستقوم الماصة الروبوتية بإضافة 30 microliters من الوسط إلى جميع الآبار.

لوحة الـ 84 بئر رقم 3. ثم باتباع النموذج، يُضاف 200 µL من الدواء بتركيز يعادل 20 ضعف التركيز الأقصى إلى كل بئر في لوحة المعايرة الدقيقة باستثناء بئر التحكم. يُضاف إلى بئر التحكم وسط غذائي مكمل بـ FPS وبلازما المريض والمضادات الحيوية.

بعد ذلك، ضع صندوق رؤوس ماصات سعة 120 µL في المحطة A، ولوحة المعايرة الدقيقة التي تحتوي على العقاقير في المحطة B، ولوحة ذات 3 84 بئراً تحتوي على الوسط الزراعي في المحطة C، ثم قم بتحميل برنامج لوحة العقاقير. سيقوم جهاز الماص الآلي بعمل تخفيف تسلسلي من 1 إلى 3 كما هو موضح في هذا الشكل. الآن ضع صندوق رؤوس ماصات سعة 120 µL جديد في المحطة A، واللوحة ذات 3 84 بئراً التي تحتوي على العقار المخفف في المحطة B، واللوحة ذات 3 84 بئراً التي تحتوي على الخلايا المستزرعة في المحطة C، ثم قم بتشغيل برنامج إضافة العقار.

سوف تقوم الماصة الروبوتية بنقل 8 µL من الدواء من كل بئر في لوحة الدواء إلى البئر المقابل لها في لوحة الخلايا. بعد معالجة البئر الأخيرة، انقل لوحة الخلايا فوراً إلى الحاضنة الخاصة بالمجهر الرقمي. ومن ثم، ولتصوير الخلايا، قم بتنظيف الجزء الداخلي من الحاضنة المكتبية بمسحة مبللة بالإيثانول، واستبدل غطاء اللوحة بغطاء الحاضنة بعناية.

بعد ذلك، اتبع خطوات البرنامج لإضافة العلامات المرجعية لمناطق الاهتمام التي سيتم تصويرها بالتتابع خلال التجربة. وأخيرًا، باستخدام عدسة شيئية بقوة تكبير 5 أو 10x، قم بضبط تركيز الخلايا حتى تظهر خلايا المايلوما المتعددة كأقراص مضيئة محاطة بحلقة داكنة، بينما تكون الخلايا السدوية بالكاد مرئية. في هذه التجربة، تم تلوين خلايا المايلوما المتعددة الحية بلون أخضر اصطناعي، مع ملاحظة انعدام أو ضعف الإشارة الخضراء في الخلايا السدوية وخلايا بطانة الوريد السري البشري في نهاية التجربة عند أعلى تركيز للدواء، وذلك عندما تكون جميع خلايا المايلوما المتعددة قد ماتت.

تم استخدام برنامج الروبوت بعد ذلك لرصد الفقدان التدريجي للحيوية الناتج عن التعرض لتركيزات مختلفة من الدواء على مدى فترة زمنية. ومن المهم مراقبة جميع الآبار الملقحة بعناية قبل بدء عملية التصوير، حيث أن الشوائب قد تضلل برنامج تحليل الصور وتؤدي إلى نتائج خاطئة. على سبيل المثال، تظهر هنا نتيجة الكثافة المفرطة للخلايا السدوية أو طول الفترة الزمنية الفاصلة بين عملية التربسين والتلقيح، مما أدى إلى تكوين تكتلات خلوية كما هو موضح في هذه الصورة.

إذا تم استزراع الخطوط الخلوية بكثافات عالية، فإنها ستشكل مستعمرات أثناء تكاثرها، مما يقلل من دقة خوارزمية تحليل الصور الرقمية حيث يصبح من الصعب بشكل متزايد تمييز خلية عن أخرى؛ وفي هذه الحالة، يكون عدد خلايا الورم النقوي المتعدد التي تم استزراعها قليلاً جداً عندما يكون عدد خلايا الورم النقوي المتعدد التي تم الحصول عليها من شفط نخاع العظم أقل من 500,000. ومن الضروري تحديد الحجم الميت للأنبوب المستخدم قبل استزراع الخلايا وإدراج هذا الحجم في حسابات التخفيف. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إبقاء الوسط المخلوط مسبقاً والذي يحتوي على الكولاجين على الثلج لمنع البلمرة قبل أن تصبح الخلايا جاهزة. كما ساعد ذلك في استكشاف كيف يمكن لعدم التجانس في الحساسية الكيميائية للعبء الورمي أن يحدد عمق ومدة استجابة المريض.