نموذج الأنسجة 3D الرئة الإنسان للدراسات وظيفية على المتفطرة السلية العدوى

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء نموذج أنسجة الرئة في المختبر لدراسات عدوى السل M. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع طبقات من مصفوفة الكولاجين الليفية أولا على مرشح إدراج لوحة زراعة الخلية. في الخطوة الثانية ، يتم وضع الخلايا المناعية والظهارية المصابة على طبقة الكولاجين الليفية.

يتم عرض نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد الناتج للهواء لتسهيل إفراز المخاط والتقسيم الطبقي للظهارة. في الخطوة الأخيرة ، يتم حصاد الأنسجة وتركيبها. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي لتحليل تكوين الورم الحبيبي المبكر الناجم عن مرض السل M.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو الطرق الحالية ، مثل الطبقة الأحادية في المختبر من الخلايا ، هي أن الخلايا الموجودة في هذا النظام موجودة في بيئة مكروية ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح بتكوين الأورام الحبيبية عند الإصابة بالبكتيريا الدقيقة الخبيثة التي تشبه السل البشري لتحضير الخلايا الليفية المدمجة في الكولاجين ابدأ بمعالجة خلايا الخلايا الليفية الرئوية بالتريبسين لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية عندما تنفصل الخلايا ، أوقف التفاعل بثمانية ملليلتر من DMEM الكامل ثم قم بتدوير الخلايا. أعد تعليق الكريات عند 230 ، 000 خلية لكل مليلتر في dmm الطازج وضع الخلايا على الجليد. بعد ذلك ، أضف إدخالا واحدا لكل بئر في ستة.

قم بإعداد مليلتر واحد من خليط الطبقة الخلوية المحضر حديثا في كل ملحق ، مع التأكد من أن الخليط يغطي الملحق بالكامل دون أي فقاعات هواء. ثم ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، امزج ملليلترين من الكولاجين مع 615 ميكرولترا من الخلطة المسبقة في أنبوب مخروطي معقم على الثلج لتحييد درجة الحموضة في الكولاجين لكل إدخال.

ثم أضف 58 ميكرولترا من dmem الكامل و 327 ميكرولترا من الخلايا الليفية الرئوية لكل إدخال إلى خليط الكولاجين. سحب لأعلى ولأسفل لتوزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء الخليط. أضف الآن بسرعة ثلاثة ملليلتر من الطبقة الخلوية أسفل جانب كل ملحق على كل طبقة كولاجين لا خلوية.

الحرص على تجنب فقاعات الهواء وإعادة اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعتين أخريين. بعد بلمرة الكولاجين ، أضف ملليلترين من dmem الكامل إلى قاع كل بئر ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم التالي ، استخدم زوجا من الملقط النظيف لرفع الإدخالات بعناية واحدة تلو الأخرى وشفط وسط الثقافة من أسفل كل منها.

حسنا ، أضف ملليلترين من DMM الكامل إلى قاع كل بئر ، ومليلترين من DMM الكامل لكل إدخال. تغيير كلا المجلدين من الوسيط كل يومين لمدة خمسة إلى سبعة أيام. لتحضير البلاعم المصابة، ابدأ باحتضان مزرعة البلاعم لمدة أربع ساعات مع السل M الخبيث بعدوى متعددة قدرها 10.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة البكتيريا خارج الخلية ومعالجة البلاعم باثنين من المليمولات ، A DTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما تنفصل الخلايا عن المقاومة ، قم بتعليقها في dmm كامل خال من المضادات الحيوية. ثم استنشق كل الوسط من لوحة مصفوفة الكولاجين الليفية وأضف 1.5 مل من DMM الكامل الخالي من المضادات الحيوية الطازجة إلى الغرف الخارجية.

بعد ذلك ، امزج الخلايا الوحيدة ذات العلامات الفلورية مع البلاعم المصابة بنسبة خمسة إلى واحد في 50 ميكرولترا من DM EM الكامل الخالي من المضادات الحيوية لكل إدراج. ثم أضف 50 ميكرولترا من خليط البلاعم أحادي الخلية إلى داخل كل ملحق وأعد اللوحة إلى الحاضنة. بعد ساعة واحدة ، أضف ببطء ملليلترين من الثقافة ، وقم بوضع متوسط أسفل جدران الإدخالات لتجنب إزاحة الخلايا واحتضان الثقافات لمدة 24 ساعة أخرى.

لزرع الثقافات بالخلايا الظهارية الرئوية ، أضف 4 ملايين خلية ظهارية لكل مليلتر في 50 ميكرولترا من dmm الكامل فوق مصفوفات الكولاجين الليفية للخلية المناعية. احتضان الخلايا لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، تليها ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. ثم أضف برفق ملليلترين من DMM الخالية من المضادات الحيوية إلى الإدخالات كما هو موضح للتو ، وقم بزراعة الخلايا لمدة ثلاثة أيام أخرى.

بعد خمسة أيام من البذر ، تستنشق البلاعم المصابة كل وسط الاستزراع من اللوحة وتضيف 1.8 مل من DMM الكامل الخالي من المضادات الحيوية إلى الغرف الخارجية. ثم كشف الهواء عن نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد في الحاضنة لمدة يومين دون إضافة وسيط إلى الإدخال في اليوم السابع. بعد البذر.

قم بإزالة الوسيط بالكامل من اللوحة واخلط نماذج المناديل مع 4٪ بارالديهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم باستخدام مشرط ، افصل الأغشية عن إدراج البئر. بعد ذلك ، استخدم مشرطا نظيفا لإزالة جوانب نماذج الأنسجة بعناية وتقطيع كل منديل إلى أربع قطع مربعة متساوية الحجم تقريبا.

انقل القطع إلى شرائح زجاجية فائقة الصقيع واتركها تجف لمدة خمس دقائق. ثم باستخدام تركيب الفلورسنت ، الذي يحتوي على مضاد للبهتان و dpi ، قم بتركيب المناديل وتغطيتها بزلات الغطاء. اترك الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى تجف ، ثم أغلق حواف زلة الغطاء بطلاء الأظافر.

عندما يجف الورنيش ، اغمر الشرائح في 70٪ من الإيثانول لنقلها من منشأة BSL الثلاثة. لتصور الأنسجة ، احصل على صور ثلاثية الأبعاد لخمسة إلى 10 حقول مختلفة تغطي قطعة الأنسجة بأكملها بدقة 512 × 512 مع تغطية زاك بسمك لا يقل عن 20 ميكرون مع فصل واحد إلى 1.5 ميكرون بين الأكوام على مجهر متحد البؤر الفلوري للقياس الكمي ثلاثي الأبعاد لمجموعات الخلايا. افتح برنامج معالجة الصور ثلاثية الأبعاد وقم بتحميل الصورة التي تهمك.

بعد ذلك ، باستخدام أداة ضبط العرض ، اضبط كل قناة للصورة والتباين والسطوع وعتامة المزج لتحسين عرض مستوى الصوت وتقليل تداخل الضوضاء. ثم لتصور سطح الأنسجة ، حدد قناة الخلايا الأحادية الحمراء وقم بتعيين العتبات المناسبة باستخدام المرشحات لتقييد اختيار الخلايا الوحيدة الحمراء أو لاستبعاد الخلفية حسب الضرورة. أخيرا ، قم بتصدير البيانات إلى برنامج جداول البيانات المناسب لمزيد من التحليل النهائي.

في اليوم السابع ، يكشف الفحص المجهري متحد البؤر لبذر الخلايا المصابة بالسل M عن مجموعة من الخلايا الوحيدة الحمراء في موقع العدوى ، كما لوحظ من خلال وجود البكتيريا الخضراء التي تحاكي آفات السل البشري المعروفة باسم الورم الحبيبي 3D. يوفر التصور مرونة التفاعل والفحص والقياس الكمي للعديد من الميزات. صورة ثلاثية الأبعاد، على سبيل المثال، في هذه الصور تصور مجموعة من الخلايا الوحيدة في موقع السل.

يمكن ملاحظة الترتيب المكاني للبكتيريا الخضراء ومجموعات الخلايا الوحيدة الحمراء من الآراء القمية والدورانية والجانبية. كما هو متوقع ، لم يتم ملاحظة هذه العناقيد في الأنسجة غير المصابة. كشف القياس الكمي لحجم وعدد الخلايا الوحيدة ومجموعات الخلايا والأنسجة المصابة بالسل M أن حجم مجموعات الخلايا قد تم تعزيزه بينما ينخفض عدد الخلايا الوحيدة الفردية مقارنة بنماذج الأنسجة غير المصابة.

يشمل المستخدمون المحتملون لنموذج أنسجة الرئة هذا دراسة دور الخلايا المناعية المختلفة ومناعة الأنسجة في السل ، ودراسة الأنماط الظاهرية للبكتيريا الفطرية واختبار الأدوية المرشحة التي تقتل البكتيريا الفطرية داخل الورم الحبيبي.