طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي

تتمثل الأهداف العامة للتجارب التالية في تحديد تأثيرات NTBC على إنتاج P mein والحساسية للإجهاد التأكسدي، بالإضافة إلى تحديد التركيزات المثبطة الدنيا للمضادات الحيوية أو الـ mics. ويتحقق ذلك عن طريق إضافة NTBC إلى المزارع البكتيرية لتحديد التركيز الذي يقلل من إنتاج p melanin كخطوة ثانية. يتم معالجة المزارع البكتيرية باستخدام NTBC والمضادات الحيوية، مما سيتيح للمستخدم تحديد ما إذا كانت المعالجة بـ NTBC لها تأثير على الـ M mics الخاصة بالمضادات الحيوية.

تُعرَّض المزارع المعالجة بـ NTPC لبيروكسيد الهيدروجين من أجل تحديد الحساسية للإجهاد التأكسدي، وتُظهر نتائج المعالجة بـ NTPC أن معالجة البكتيريا الجينية بـ NTPC تؤدي إلى انخفاض في إنتاج الصبغة وزيادة الحساسية للإجهاد التأكسدي، بينما لا تؤثر على قيم MIC للمضادات الحيوية، وذلك بناءً على أطباق البقع الخاصة بالاستجابة للإجهاد التأكسدي ومقايسات MIC في أطباق معايرة دقيقة على التوالي. وتتمثل الميزة الرئيسية لتقنية أطباق البقع الخاصة بالإجهاد التأكسدي مقارنة بالطرق الحالية، مثل تعداد الخلايا الحية ومقايسات الانتشار القرصي، في إمكانية استخدام تركيزات أقل من بيروكسيد الهيدروجين بدلاً من التركيزات العالية المستخدمة في المقايسات الأخرى. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في طريقتنا لتحديد قيم MIC للمضادات الحيوية صعوبة بسبب نقص الدقة في تقنية الماصّة، مما يؤدي إلى تباين بين المكررات.

يمكن أن يجعل هذا التباين من الصعب تحديد التركيز المثبط الأدنى (MIC) للمضاد الحيوي بدقة. قبل يوم واحد من مقايسة MIC، يتم تحضير مستنبتات السلالات المراد اختبارها في وسط LB بوجود وبدون.

مادة 2-نيترو-4-تري-إيثيل-بنزويل-1،3-سيكلوهكسان ديون، أو NTBC. يستخدم هذا العرض التوضيحي مستوىً تمثيلياً قدره 300 µM من مادة NTBC. تم وصف طريقة المعايرة لتحديد التركيز المناسب لـ NTBC في نص البروتوكول؛ يتم تحضين المزارع طوال الليل عند 37 °C مع التهوية في اليوم التالي.

قم بتحضير المحاليل الرئيسية من وسط LB مضافاً إليه NTBC ووسط LB مضافاً إليه DMSO لاختبار التركيز المثبط الأدنى (MIC) لاختبار مضاد حيوي واحد لسلالة واحدة، وذلك بإضافة 600 micromolar من NTBC إلى 2 milliliters من وسط LB ثم الخلط. لتحضير المحلول الرئيسي لـ NTBC، يُضاف NTBC بتركيز 600 micromolar لأنه سيخضع للتخفيف بمقدار الضعف عند إضافة اللقاح.

للحصول على تركيز نهائي قدره 300 micromolar، أضف حجماً مكافئاً من المذيب DMSO إلى مليليترين من LB واخلط لتجهيز المحلول الرئيسي NO NTBC. سيتم استخدام هذين المحلولين الرئيسيين لتحضير المحاليل المخزنة للمضادات الحيوية وكذلك لإعداد سلسلة التخفيف في أطباق 96 well. بعد ذلك، قم بتحضير محاليل المضادات الحيوية في المحاليل الرئيسية LB plus NTBC أو LB plus DMSO.

قم بتحضير المحلول المخزون من Gentamycin مع أو بدون NTBC بتركيز 64 micrograms per milliliter. قم بتحضير المحلول المخزون من KANAMYCIN مع أو بدون NTBC بتركيز 256 micrograms per milliliter. قم بتحضير المحلول المخزون من tobramycin مع أو بدون NTB بتركيز eight micrograms per milliliter.

بعد تحضير محاليل المضادات الحيوية بتركيز 2x، يتم وضع 100 µL من كل محلول مضاد حيوي في أربعة آبار في الصف A من طبق معايرة يحتوي على 96 بئراً. على سبيل المثال، يوضع gentamycin في الآبار من 1 إلى 4، وkanamycin في الآبار من 5 إلى 8، وtobramycin في الآبار من 9 إلى 12. أضف 50 µL من المحلول الرئيسي (master solution) لـ LB plus NTBC أو LB plus DMSO إلى الصفوف من B إلى H في طبق الـ 96 بئراً، مع التأكد من أن طبقاً واحداً يحتوي على LB plus NTBC والطبق الآخر يحتوي على LB plus DMSO. باستخدام الماصة الدقيقة (micropipetter)، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار ضعفين للمضادات الحيوية عن طريق نقل 50 µL من المحلول من الصف A إلى الصف B. امزج المحلول، ثم استبدل رؤوس الماصة وانقل 50 µL من المحلول من الصف B إلى الصف C. كرر هذه العملية لبقية الصفوف بعد تخفيف الصف G. قم بإزالة 50 µL من المحلول من ذلك الصف وتخلص منها.

استخدم الصف H كعنصر تحكم خالٍ من المضادات الحيوية لنمو البكتيريا. استعد المزارع التي حُضنت طوال الليل بعد غسل جميع المزارع للتخلص من الـ lanin الموجود في الأوساط الغذائية، ثم قم بقياس OD 600 للمزارع وقم بتخفيف المزارع التي حُضنت طوال الليل في lb باستخدام ماصة ميكروية متعددة القنوات.

أضف 50 µL من المزرعة البكتيرية المخففة إلى الآبار المناسبة. أضف البكتيريا إلى ثلاثة آبار لكل سلالة ولكل تركيز من المضاد الحيوي. أضف 50 µL من LB إلى البئر الرابع ليكون بمثابة ضابط للتلوث البكتيري.

قم بتغطية ألواح الـ 96 بئراً بغشاء البيرفيل (perfil) واحضنها لمدة 24 ساعة تقريباً عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. افحص الألواح بصرياً للتأكد من نمو البكتيريا في الآبار. يمثل التركيز المثبط الأدنى (MIC) أقل تركيز للمضاد الحيوي الذي لا يظهر عنده نمو بكتيري في جميع المكررات الثلاثة لكل سلالة.

لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير مزارع ليلية للسلالات المراد اختبارها في وسط LB مع وبدون NTBC كما تم توضيحه سابقاً. وفي اليوم التالي، قم بتحضير أوساط LB APLs تحتوي على بيروكسيد الهيدروجين كعامل إجهاد تأكسدي. أولاً، قم بصهر دوارق LB agro وتبريد الوسط إلى حوالي 50 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، أضف بيروكسيد الهيدروجين مباشرة إلى الأوساط المبردة بالتراكيز المطلوبة. قم بتدوير القارورة لخلط مجموعة من تراكيز بيروكسيد الهيدروجين تتراوح من صفر إلى واحد. ويُعد التركيز مليمولار نقطة بداية جيدة.

قم بصب الأطباق على الفور وعقّم السطح باللهب لإزالة الفقاعات. تبلغ الإنتاجية أربعة أطباق لكل 100 milliliters من lb agar. قم بتمييز الأطباق بتركيز hydrogen peroxide.

ضع الأطباق دون غطاء في غطاء تدفق بيولوجي مع تشغيل المروحة لمدة 30 دقيقة لإزالة الرطوبة الزائدة من الأطباق. يجب استخدام الأطباق في نفس اليوم. وأثناء تجفيف الأطباق، قم بالغسل والقياس.

تُستخدم قيمة OD 600 للمزارع الليلية لتوحيد OD 600 لجميع المزارع الليلية وفقاً لأدنى قيمة ضمن مجموعة السلالات التي يتم اختبارها. وللقيام بذلك، حدد حجم المزرعة اللازم لتخفيف المزرعة وصولاً إلى أدنى قيمة OD 600 في حجم إجمالي قدره واحد مللي لتر. على سبيل المثال، إذا كانت قيمة OD 600 للمزرعة هي 3 وأدنى قيمة OD 600 لمجموعة السلالات هي 2.5، قم بإجراء الحساب التالي، والذي سينتج عنه 0.833 مللي لتر كحجم المزرعة المطلوب، ثم ضع 0.833 مللي لتر من المزرعة في أنبوب طرد مركزي صغير (micro fuge tube).

بعد ذلك، احسب كمية LB مضافاً إليها NTBC أو LB مضافاً إليها DMSO المطلوبة للوصول بحجم المزرعة إلى واحد مللي لتر. في هذا المثال، ستكون الكمية 0.167 مللي لتر. اخلط عن طريق الرج الدوامي (vortexing) للحفاظ على المزارع في تركيز ثابت من NTBC أو DMSO. قم بإجراء تخفيف تسلسلي عشري للمزارع الليلية المقيسة في PBS مضافاً إليه NTBC أو PBS مضافاً إليه DMSO. قم بتحضير محاليل مخزنة من PBS مضافاً إليه NTBC وPBS مضافاً إليه DMSO، مع زيادة أو تقليل الكميات بناءً على عدد السلالات التي يتم اختبارها. بالنسبة لمجموعة واحدة من التخفيفات لسلالة واحدة، اخلط 300 micromolar من NTBC أو حجماً مكافئاً من DMSO مع PBS، ليصل الحجم الإجمالي إلى 720 microliters. أضف 90 microliters من PBS مضافاً إليه NTBC أو PBS مضافاً إليه DMSO إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المناسبة والمصنفة للتخفيف التسلسلي من 10⁻¹ إلى 10⁻⁷.

أضف 10 µL من المزرعة إلى أنبوب التخفيف المناسب 10⁻¹ مع الخلط باستخدام جهاز vortex، ثم انقل 10 µL من تخفيف 10⁻¹ إلى أنبوب التخفيف 10⁻². كرر هذه العملية مع تغيير رؤوس الماصة بين كل تخفيف حتى يتم إجراء جميع التخفيفات. ضع 5 µL من التخفيفات من 10⁻³ إلى 10⁻⁷ على أطباق LV مضاف إليها hydrogen peroxide في نسختين مكررتين.

استخدم رأس ماصة واحد لكل سلالة. إذا تم توزيع البقع من الأكثر تخفيفاً إلى الأقل تخفيفاً، فلا تقم بهز أو إمالة الطبق حتى يجف السائل بداخله. حضن الأطباق عند 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة اعتماداً على السلالة.

بمجرد ظهور مستعمرات ذات حجم جيد، قم بتصوير الأطباق باستخدام كاميرا CCD فوق جهاز نقل الضوء (transluminator). استُخدمت معايرات NTBC لتحديد ما إذا كان NTBC قادراً على تقليل إنتاج الـ p melanin في p aerogen، ولتحديد تركيز NTBC الذي يلغي أو يقلل إنتاج الـ p melanin لاستخدامه في مقايسات إضافية كما هو موضح هنا. قلل NTBC من إنتاج PY melanin بطريقة تعتمد على الجرعة في السلالات المنتجة للـ p melanin، بينما لم يكن له أي تأثير على إنتاج الصبغة في السلالات التي لا تنتج p melanin.

يوضح هذا الجدول نتائج مقايسة التركيز المثبط الأدنى (MIC) لسلالات مختلفة من *P. aerogen* المعالجة بـ NTBC وبدونه ومع مضادات حيوية متنوعة؛ حيث تم تسجيل قيم الـ MIC كأقل تركيز من المضاد الحيوي الذي ثبط النمو البكتيري. ولم يكن للمعالجة بـ NDBC أي تأثير على قيم الـ MIC للمضادات الحيوية للسلالات التي تم اختبارها. كما أُجري مقايسة طبق النقطة (spot plate assay) لاستجابة الإجهاد التأكسدي على سلالات *P. i. o.* المنتجة للميلانين وغير المنتجة للميلانين، والمعالجة بـ NDBC وبدونه.

أظهر الطبق الذي يحتوي على صفر مللي مولار من بيروكسيد الهيدروجين أن جميع السلالات تم تخفيفها بشكل صحيح، ولوحظ زيادة في الحساسية للإجهاد التأكسدي عندما عولجت البكتيريا المنتجة لـ PIO melanin بـ NTBC؛ حيث كانت السلالات التي لا تنتج PIO melanin أكثر حساسية للإجهاد التأكسدي من السلالات المنتجة لـ p melanin. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تأثيرات العلاج بـ NTBC على إنتاج PIO melanin من خلال اختبار الحساسية للإجهاد التأكسدي والتركيزات المثبطة الدنيا (mics) للمضادات الحيوية.