النهج ماوس جولة نافذة للالسامة وكيل التسليم: A السريع وتقنيات موثوقة لإحداث قوقعة تحلل الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج لإصابة الأذن الداخلية عن طريق إيصال العوامل السامة للأذن بشكل استراتيجي ومباشر إلى تجويف النافذة المستديرة في قوقعة الفأر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح طبقة الدهون تحت الجلد وسحب الجسم العضلي برفق للكشف عن سمحاق الفقاعة الطبلية. والخطوة الثانية هي فتح الفقاعة عن طريق إزالة شظايا العظم تدريجياً حتى يتم الكشف عن تجويف النافذة المستديرة.

بعد ذلك، يتم تجفيف السائل المرئي في الأذن الوسطى وفجوة النافذة المستديرة تماماً للسماح بالرؤية المثلى لفجوة النافذة المستديرة. وتتمثل الخطوة النهائية في ملء فجوة النافذة المستديرة بعامل السُميّة الأذنية المختار دون إلحاق ضرر بالشريان السباتي الخارجي (STA pedial artery)، يلي ذلك تكرارات مناسبة وفقاً لمواصفات العامل المستخدم. وفي النهاية، تُستخدم الإجراءات الوظيفية، بما في ذلك استجابة جذع الدماغ السمعية والتقييم المورفولوجي، لإظهار الحفاظ الانتقائي أو التدهور في البنية المجهرية للقوقعة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية، وهي المقياس الحالي لدينا، في أن هذا الإجراء يسمح بكشف ممتاز لثلمة النافذة المستديرة، مما يتيح التطبيق المباشر لشيخوخة سمية ذاتية انتقائية. وتشمل مزايا هذه التقنية الحفاظ على البنية المجهرية للأذن الداخلية، وتجنب السمية الجهازية، وسرعة ظهور التأثير، والتنكس الانتقائي لأنواع معينة من خلايا القوقعة، والحصول على نتائج قابلة للتكرار. ويمكن تطبيق هذه التقنية مع إجراء تعديلات طفيفة على أنواع أخرى من القوارض، بما في ذلك الجرذان، وخنازير غينيا، واليربوع.

سأقوم الآن باستعراض الإجراء في مختبري. لقد أجريت جميع جوانب الأبحاث الحيوانية وفقاً لإرشادات لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوان المختصة. كما تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية على الفقرات الموصوفة هنا بموجب إرشادات لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوان التابعة لجامعة ساوث كارولينا الطبية.

بعد تخدير الحيوان وفقاً للإجراءات المعتمدة، يتم إعطاء مسكن للآلام قبل الجراحة بجرعة 0.1 milligrams per kilogram. وقد استُخدم هنا Buprenorphine. تأكد من وصول الحيوان إلى مستوى التخدير الجراحي.

يجب ألا تكون هناك استجابة لقرص إصبع القدم، كما يجب أن يكون منعكس الكتابة غائباً في الفئران كما هو موضح هنا. اسحب 0.2 milliliters من محلول مائي يحتوي على العامل السمي للأذن المختار في حقنة توبيركولين سعة واحد milliliter مزودة بإبرة غير مدببة مقاس 28 gauge وطول نصف بوصة، ثم قم بتفريغ أي هواء داخل الحقنة لأن الفقاعات يمكن أن تمنع التطبيق الصحيح للعامل. استخدم مقصات كهربائية لإزالة الفراء في المنطقة، ممتدة من الثنية الرأسية، وصولاً إلى حزام الكتف بعناية.

قم بتوسيع منطقة إزالة الشعر من الخط الناصف السهمي الظهري وصولاً إلى زاوية الفك السفلي جانبياً. استخدم شفرة حلاقة تستخدم لمرة واحدة لضمان تحضير المنطقة بحلاقة نظيفة. قم بتعقيم جلد المنطقة المحضرة وفقاً للبروتوكولات المؤسسية.

هنا يتم تطبيق Betadine بالتناوب مع الإيثانول موضعياً وبحركة دائرية لمدة دقيقتين. ضع وسادة تدفئة صغيرة تحت الجسم للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان. عند درجة حرارة تتراوح بين 36 إلى 38 °C، قم بتثبيت رأس الحيوان بواسطة جهاز تثبيت الرأس.

أحكم ربط مشبك صغير برفق فوق ظهر خطم الحيوان لتثبيته في مكانه. تأكد من أن حامل الرأس متصل بإحكام بمركز ذراع مفصلي على شكل حرف U. قم بتثبيت قضيب بعرض 1 cm على الذراع الأيسر لحرف U ليُستخدم كمسند للرأس من الجانب الأيسر للسماح بالوصول إلى الجانب الأيمن.

بمجرد تثبيت الفأر بإحكام في حامل الرأس، قم بتدويره لوضعه في وضعية الاستلقاء الجانبي الأيسر. ضع الجسم بعناية على سطح الجراحة المسطح لضمان استقراره طوال الإجراء وتجنب إجهاد الالتواء المفرط على الفقرات العنقية. ضع مجهراً جراحياً قادراً على التكبير بمقدار 10x و 20x فوق المجال الجراحي.

تأكد من قدرة المجهر على الحفاظ على موضعه دون الحاجة إلى تثبيته يدوياً، بحيث يمكن استخدام كلتا اليدين في الجراحة أثناء العمل تحت التكبير المجهري. استخدم مقصاً حاداً أو شفرة مشرط لإجراء شق خلف الأذن بطول 1 إلى 1.5 سنتيمتر، على مسافة تتراوح بين ستة إلى ثمانية مليمترات تقريباً من الثنية الرأسية للأذن. تجنب القطع العميق للحفاظ على البنى الوعائية الموجودة تحته.

قم بإجراء تشريح غير حاد عبر طبقة الدهون تحت الجلد. في حال التشريح في اتجاه من الناحية البطنية إلى الناحية الإنسية، توخَّ الحذر لتجنب الوريد الوداجي الخارجي. وإذا حدث نزيف، استخدم الجيلاتين القابل للامتصاص، أو الإسفنج، أو كرات القطن لوقف التدفق.

بمجرد تقسيم طبقة الدهون بشكل صحيح، قم بكشف العضلات الرقبية. وتعد إحدى العلامات التشريحية الهامة هي فرع عصبي صغير من العصب القحفي 11 الذي يلتف حول الحافة الخلفية للـ C CTO mastoid. وللتمديد roly باتجاه صيوان الأذن، استخدم مباعداً ذاتياً لتقليص جسم عضلة CTO mastoiditis بلطف في اتجاه خلفي.

قم بفصل اللفافة الشفافة التي تغلف جسم العضلة برفق. كما يجب سحب الغدة النكفية والوريد الوداجي الخارجي برفق في الاتجاه المعاكس. ومع سحب جسم عضلة CTO Masto بشكل جيد، تظهر القبة اللامعة لسمحاق الفقاعة الطبلية عند الجانب الإنسي للفقاعة، وهي نقطة اندغام عضلة عنقية أعمق.

ستظهر منطقة التهاب الخشاء القصي الترقوي. ضع مبعداً ذاتي التثبيت لإبقاء منطقة الخشاء في الجانب المقطوع (CTO) مفتوحة باستخدام تقنية اليدين، واستخدم كيّاً ثنائي القطب بلطف لفصل السمحاق البصلي وكشف العظم الكامن تحته. بعد ذلك، استخدم ملقطاً أو مسباراً أذنيّاً مقوساً لرفع السمحاق ودفعُه بلطف في اتجاه محيطي لكشف قبة البصلة بشكل كامل.

استخدم الآن مثقاب أسنان يدوي يعمل بالسير مع رأس مستدق بمقاس واحد أو اثنين مليمتر لحفر ثقب تجريبي بمقاس 2 مليمتر بعناية عبر عظم البولا (bullah bone). احفر بين الحافة الظهرية للقبة والخط العاتم المرئي الذي يمتد عبر الجانب المنقاري من البولا. بعد ذلك، احفر بعناية ثقباً تجريبياً ثانياً في مكان قريب. ولتسهيل عملية إزالة سقف عظم البولا، استخدم ملقط رؤوس مجوهرات لفتح عظم البولا في اتجاه ظهري وظهراني.

احرص على عدم ثقب شريان العضلة الباسطة الطويلة للأصابع (EDL) الذي يقع مباشرة تحت السدادة العظمية (bullock cap). قلل من كمية العظم المزال لمنع دخول السوائل بشكل مفرط إلى الأذن الوسطى قبل تطبيق المادة. استخدم فتيلة ورقية لإزالة جميع السوائل المرئية في الأذن الوسطى وتجويف النافذة المستديرة حتى يظهر العظم الجاف.

تعد هذه الخطوة حاسمة لنجاح البروتوكول. أثناء فحص المنطقة تحت أقصى تكبير، استخدم إبرة رفيعة القطر مثبتة على حقنة توبيركولين سعة 1 ml لوضع قطرة واحدة من العامل السام للأذن (Ototoxic agent) مباشرة في تجويف النافذة المستديرة بحيث يملأه تماماً. اترك العامل في تجويف النافذة المستديرة لمدة 10 دقائق.

في المراحل المبكرة، راقب بدقة استبدال الانعكاس الضوئي الصغير عند قاعدة التجويف الجاف بمنيسك سائل باهت وضبابي. يشير هذا إلى أن التجويف يمتلئ بشكل صحيح. عند مرور 10 minutes كاملة، قم بسحب العامل تماماً واستبدله بتطبيق جديد من العامل نفسه.

يعتمد عدد مرات التطبيق على العامل المستخدم. يتراوح وقت التعرض عادةً بين 30 إلى 60 دقيقة. بعد التطبيق النهائي، اترك الفتحة غير مغطاة واستخدم الملقط لإغلاق الأنسجة الرخوة فوق الموقع الجراحي.

استخدم خيط جراحة أحادي الخيط غير قابل للامتصاص بمقاس 4-0 لإغلاق الجلد فوق موقع الجراحة. اترك الحيوان ليتعافى من التخدير في قفص منزلي نظيف، يجب أن يكون مجهزاً بفرشة وطعام لين. راقب الحيوانات يومياً حتى وقت القتل الرحيم وحصاد أنسجة القوقعة من فئران adult C-B-A-C-A-J.

تم تعريض الفئران من كلا الجنسين للعامل السام للأذن Hept ethanol. انتشار النافذة المستديرة. لوحظت زيادات ملحوظة في عتبات BR في الفئران المعالجة بـ hept من اليوم الأول بعد الجراحة إلى اليوم 14 مقارنة بالحيوانات الضابطة التي خضعت لجراحة وهمية مع إعطاء محلول ملحي بدلاً من hept.

لم يظهر الإيثانول تحولات كبيرة في العتبة عند أي تردد تم اختباره. استُخدم التلوين المناعي ضد قناة بوتاسيوم مقومة للداخل، والموضحة باللون الأخضر، كوسيلة غير مباشرة لتصور تلف وتعافي البنى القوقعية. وقد انخفضت كثافة التلوين بشكل ملحوظ داخل theria vais.

في اليوم الأول بعد الجراحة، ظهرت أدلة على اختلال السلامة النووية وتكثف الكروموسومات، وهو ما يعد نموذجيًا للموت الخلوي المبرمج (apoptosis)، وذلك في الصبغ النووي المضاد الموضح باللون الأحمر. وعندما تم قياس كثافة صبغ قنوات البوتاسيوم في مناطق الآذان المعالجة بـ stratis، ظهر انخفاض أولي متبوعًا بتحول ملحوظ للعودة نحو كثافة مجموعة الضبط بعد سبعة أيام من التعرض لـ hept، مع استمرار التعافي بعد ذلك. وبمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن تنفيذه في غضون 30 إلى 60 دقيقة إذا تم القيام به بشكل صحيح.

من المهم تذكر أن التعرض الإضافي أو التعويض قد يساعد في تجنب التخفيف غير المرغوب فيه للعامل السام ذاتياً بفعل تكثف الدم أو السائل الخلالي. ومع ذلك، يجب توخي الحذر عند اتباع هذا النهج لأنه يميل إلى زيادة خطر إصابة الشريان القوقعي عن غير قصد أو إدخال السائل الخلالي إلى مكان النافذة المستديرة. تتيح هذه التقنية طفيفة التوغل دراسة مفصلة للعمليات الكيميائية الحيوية الدقيقة، وكانت ذات أهمية بالغة في دفع أبحاثنا الرامية إلى فهم إمكانات التجديد القوقعي في الجسم الحي (in vivo).