قياس TCR-PMHC التجليد

سنوضح في هذا الفيديو كيفية قياس الحركية بين مستقبل مستضد الخلايا التائية ومعقد التوافق النسيجي الرئيسي المحمل بالببتيد أو PMHC في C two، وذلك ضمن المشبك المناعي بين خلية تائية وطبقة ليبيدية مدعومة مستوية. وسنقدم لكم إرشاداً موجزاً حول الجوانب الهامة لإنتاج البروتين والتحقق من السلامة الوظيفية للطبقة الليبيدية عبر قياسات تدفق الكالسيوم. ولمزيد من المعلومات التفصيلية حول كيفية تحضير الطبقة الليبيدية وكيفية إعداد مجهر فلوري للجزيء الواحد، يرجى الرجوع إلى مساهمتنا الموازية في مجلة Journal of Visualized Experiments؛ ومن ثم سنشرح بالتفصيل كيفية إجراء وتحليل قياسات نقل طاقة الرنين الفلوري في bug وعلى مستوى الجزيء الواحد.

لاستنتاج حركية ارتباط مستقبل الخلية التائية التشابكي بـ PMHC لتوضيح استراتيجيتنا القائمة على FRET المستخدمة في نهجنا العام، نبدأ بالبنية البلورية لمستقبل الخلية التائية (TCR) الموضح هنا باللون الأزرق أثناء ارتباطه بمستضده، وهو جزيء MHC المحمل بالببتيد (PMHC) الموضح باللونين الأصفر والأحمر. كما نقدم شظية سلسلة واحدة من النطاقات المتغيرة من جسم مضاد تفاعلي لمستقبل الخلية التائية بيتا يُسمى age 57. ولإجراء قياسات كمية تعتمد على FRET، من الضروري وسم كل من مانح FRET، وهو في حالتنا الشظية ذات السلسلة الواحدة، ومستقبل FRET، وهو PMHC، بطريقة محددة الموقع.

يُعد هذا الأمر ممكناً بالنسبة للبروتينات المعاد تركيبها من خلال إدخال سيستين غير متزاوج، والذي يمكن ربطه تساهمياً بـ Fluor force المقترن بالميت. وكما هو موضح، نقوم بربط المانح Alexa Fluor 555 أو SI 3 بقطعة السلسلة الواحدة ومستقبل FRET، وهو Alexa Fluor 647 أو SI 5، بالنهاية الكربوكسيلية (C terminus) للببتيد المرتبط بـ MHC.

تبلغ مسافة Indy كما تظهر في هذا التركيب المركب حوالي 41 angstrum، وهي أقل حتى من نصف القطر الأول، وهو مسافة نصف الحد الأقصى لنقل الطاقة بين الصبغتين. في تجاربنا، نستخدم طبقات ثنائية من الدهون مدعومة بزجاج مستوٍ كخلايا بديلة مقدمة للمستضد. يتم وظيفياً تعديل هذه الخلايا باستخدام PMXC، وجزيء الاتصال B seven one، وجزيء الالتصاق I chem one.

بهذه الطريقة، يمكن إجراء التصوير بنمط فلورة الانعكاس الداخلي الكلي، والذي يضيء الفلور في منطقة قريبة جداً من السطح الفاصل، مما يقلل بشكل كبير من الخلفية الخلوية. ولا يمكن الكشف عن Fret إلا عندما ترتبط TCRs المسمى بقطع السلسلة الواحدة بـ PM hcs المدمجة في الطبقة. وهذا يتيح لنا تصور ارتباط T-C-R-P-M-H-C ومن ثم حساب حركية الارتباط في C two histo gene Tact المطوي بشكل صحيح.

يتم تنقية الأجزاء خارج الخلوية من P seven one و I chem one من طفوات مزارع الخلايا الحشرية المصابة بفيروس BUC المقابل. وتتم عملية التنقية في ثلاث خطوات، تبدأ بكروماتوغرافيا الألفة باستخدام النيكل anti aros، تليها كروماتوغرافيا التبادل الأيوني والكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم. يتم التعبير عن ثنائيات heterodimers من MHC Class two ذات وسام Histo tag في بكتيريا e coli على شكل أجسام اشتمالية، ثم يتم إعادة طيها في المختبر عند درجة حرارة 4 °C وبوجود ببتيد حامل للفراغ من خلال التخفيف السريع في محلول منظم للاختزال والأكسدة.

سيتم لاحقاً شطر الببتيد الحافظ للمكان عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية UV. تُمثل معقدات PMHC المطوية بشكل صحيح تلك التي تم تنقيتها وتركيزها من الببتيد الحافظ للمكان. يتم شطر الببتيد واستبداله بالببتيد الفلوري عند pH 5.2.

يتم تنقية المنتج النهائي بناءً على الحجم. يتم التعبير عن الجزء ذي السلسلة الواحدة مع سيستئين غير مرتبط على شكل أجسام اشتمالية في بكتيريا e coli، ثم يُعاد طيه في المختبر من خلال الديلزة التدريجية والتنقية بناءً على الحجم. بعد ذلك، يتم وسمه عبر السيستئين غير المرتبط باستخدام صبغة مقترنة بالـ maleimide، ثم يُنقى مرة أخرى بناءً على الحجم.

يتم في النهاية إجراء الديلزة لجميع البروتينات المعاد تركيبها مقابل محلول PBS يحتوي على 50% glycerol، وتُركّز لتصل إلى 1 mg من البروتين لكل ml، ثم تُحفظ لفترة طويلة عند درجة حرارة -20 °C. استخدم صبغة URA two المقياسية لقياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا التائية كوسيلة للتحقق من القدرة التحفيزية لـ lipid blay. قم بتحميل الخلايا التائية المنفجرة بـ URA 2:00 AM ester.

يدخل هذا المركب إلى الخلايا عبر مجموعة AM الخاصة به، ثم يتم احتجازه في الداخل من خلال عمل إنزيمات الإستريز التي تفصل جزء AM. أضف fira 2:00 AM إلى حوالي 3 مليون من الخلايا التائية بتركيز نهائي قدره five microm MO per liter. انقل الخلايا من طبق الـ 24 بئراً إلى أنبوب جديد واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

اغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول التخزين الخاص بالتصوير الذي يحتوي على محلول هانكس الملح المصنف (Hanks buffered saline solution) بما في ذلك الكالسيوم والمغنيسيوم و 1% من الألبومين. ولمراقبة الكالسيوم داخل الخلايا، استخدم نظام مجهر مقلوب مؤتمت قادر على التعامل مع الأشعة فوق البنفسجية (UV). ابدأ بروتوكول التوقيت وأضف خليتين T محملتين على الأقل إلى طبقة الليبيد الثنائية الوظيفية الموضوعة في بؤرة التركيز على منصة المجهر، ثم التقط على فترات زمنية منتظمة صورة DIC وصورتين فلوريسنتيتين يتم تحفيزهما بضوء فوق بنفسجي بطول موجي 340 و 380 nanometer.

مباشرة بعد إجراء التلامس ثنائي الطبقة، تكتسب الخلايا التائية T cells مستويات مرتفعة من الكالسيوم كما تظهر في قراءة نسبة URA two بعد 15 دقيقة من بدء التشغيل. أضف جسماً مضاداً حاجباً إلى الخلايا يعمل على إشباع جميع مستضدات PMHC. ونتيجة لذلك، تنخفض مستويات الكالسيوم داخل الخلايا إلى مستويات الحالة غير المنشطة، والتي ستعمل لاحقاً كمرجع.

بمجرد انخفاض مستويات الأجسام المضادة الحاجبة إلى قيمة تعكس الحالة غير المنشطة، والتي نقوم بتوحيدها لتصبح واحدًا لقياسات FRET، يجب صبغ الخلايا التائية بمسبار FRET من قطعة أحادية السلسلة تفاعلية مع TCR. لكل تجربة، انقل حوالي 1 مليون خلية إلى أنبوب وقم بتدويرها بسرعة 400 G. صب الوسط الغذائي وقم بتجفيف قطرات الوسط المتبقية الملتصقة بالجدران الداخلية باستخدام منشفة ورقية؛ وذلك لضمان وصول حجم التحضين إلى الحد الأدنى وهو حوالي 30 µL كما ذكرت سابقًا.

يتم تخزين مسبار FRET بتركيز 1 mg/mL و50% glycerol عند درجة حرارة -20 °C. المسبار مُوسوم في موقع محدد إما بـ Alexa Fluor 555 أو Alexa Fluor 647 بنسبة بروتين إلى صبغة تبلغ 1:1. أضف 0.3 µL من المسبار إلى الخلايا. قم برج الراسبة بعناية عدة مرات واترك الخلايا في الحضانة لمدة 20 دقيقة على الثلج.

اغسل الخلايا باستخدام محلول تخزين التصوير المبرد بالثلج. كرر إجراء الغسيل هذا مرة واحدة. يضمن التحضين والطرد المركزي والتخزين في درجة حرارة منخفضة عدم قيام الخلايا التائية (T cells) بامتصاص المسبار الفلوري داخلياً أثناء تعرضها له.

سيؤدي ذلك إلى ارتفاع مستوى الفلورة الخلفية. علاوة على ذلك، لا تفقد الخلايا التائية المسبار في البرودة أثناء الغسيل والتخزين قبل وضع الغرفة التي تحتوي على الطبقة الثنائية على منصة تبديل المجهر. يتم استبدال PBS تدريجياً بمحلول التصوير، مع تجنب تعريض الطبقة الثنائية للهواء بأي ثمن لأن ذلك سيؤدي إلى تدميرها.

لتقليل الخلفية الخلوية، نستخدم إضاءة Turf. ولتحقيق ذلك، نقوم بوضع شعاع الإثارة عند زاوية حرجة يحدث عندها انعكاس داخلي كلي. أوقف تشغيل الإثارة، وقم بتشغيل الضوء العريض وأضف الخلايا التائية (T-cell) إلى غرفة ltec واتركها تستقر على الطبقة الدهنية.

قم بتشغيل الإثارة وتركيز إضاءة غير عشبية. يتم ملاحظة الغشاء الخلوي كحلقة على طول المحور البصري في كل مستوى بؤري، وفي الحالة العشبية تكون الغشاء القاعدي الملامس للطبقة المزدوجة فقط هو القابل للملاحظة. أما المستويات البؤرية الأعلى فلا يتم استثارتها وبالتالي لا تكون مرئية.

يبدأ بروتوكول التوقيت بنبضات إثارة حمراء وخضراء لتصوير PMHC وTCR، يليها نبضة تبييض حمراء لاستئصال المستقبل P-M-H-C-F. ثم يتم إجراء نبضة خضراء لتصوير TCR بعد تبييض المستقبل F، ونبضة حمراء للتحقق من استئصال المستقبل F، وذلك على مقياس زمني يقل عن الثانية مع أقصر تأخير ممكن بين النبضتين الخضراوين الأولى والثانية. اختيارياً، يمكن الحصول على صورة DIC في البداية، حيث يتيح تقسيم الصور ثنائية اللون الكشف المتزامن عن قناة المانح والمستقبل.

يُظهر استثارة المستقبل الملقى تراكم P HCS في المشبك التآصلي للخلايا التائية. وتؤكد هذه الصورة المسبقة وجود pmcs وتشير إلى حدوث ارتباط PMHC بوساطة TCR بالفعل. كما ينتج عن المانح الملقى صور في كلتا القناتين.

تنخفض شدة إشارة قناة المانح (donor channel) التي تم تغذيتها إلى حد ما بسبب انتقال الطاقة إلى قناة المستقبل (accepted channel) في تقنية FRET. وتتكون إشارة قناة مستقبل FRET من تسرب إشارة (bleed through) المانح والتحفيز المتقاطع (cross excitation) للمستقبل. ومع ذلك، لن تُستخدم هذه الصورة في التحليل.

في البروتوكول الحالي، تلي ذلك عملية تبييض سريعة تؤدي إلى إزالة جميع الفلوروفورات المقبولة من نوع F. إن شدة صورة المانح F Fed بعد التبييض المقبول لـ fret قد استُعيدت الآن إلى مستويات أعلى دون فقدان في الشدة في قناة fre.

يتحقق التوقع التالي لمستقبل FRET من حدوث عملية تبييض كاملة لمستقبل F. لنقم بتكبير الصورة في المشبك العصبي لتقدير استعادة المانح fed كمياً. حدد متوسط شدة الخلفية كقيمة ثابتة بغض النظر عن مستقبل FRET.

يتم إجراء التبييض الضوئي، ثم تحديد متوسط شدة التشابك وشدة مجموعة TCR ممثلة. بعد ذلك، يتم حساب مردود FRET عن طريق تطبيع الفرق قبل وبعد استئصال المستقبل f. وفي مثالنا، قمنا بقياس 16%fret للتشابك بأكمله و 26%fret للمجموعة الممثلة.

سيتم لاحقاً تحويل نواتج fRET لعناقيد TCR إلى نسب إشغال TCR، والتي تؤدي بدورها إلى بيانات جزيء واحد لثابت التفكك التشابكي ثنائي الأبعاد. يساعدنا ذلك في استنتاج حركية ارتباط TCR بالببتيد و MHC في التشابك العصبي لتجارب fRET للجزيء الواحد. نستخدم نفس الكواشف واستراتيجية الوسم المستخدمة سابقاً.

ومع ذلك، ولضمان أننا نرصد بالفعل التفاعل بين TCR واحد و pMHC واحد، فقد اخترنا استيفاء المعيار التالي. يجب أن يتطابق حدث مرشح لـ fre لجزيء واحد مع جزيء fre مستقبل أو جزيء fre مانح واحد. نستخدم هنا pMHC واحد كجزيء fre مستقبل للتحقق من طبيعة الجزيء الواحد لحدث fre المرصود، ولكن المنطق المعاكس ينطبق أيضاً.

يُعد استخدام مستقبلات باللون الأخضر في القنوات العلوية ومانحات باللون الأحمر في القنوات السفلية خياراً متاحاً بالتأكيد. عادةً ما نقوم بتعريض الخلايا التائية التي تتلامس مع طبقة دهنية محفزة لإثارات ضوئية بطول موجي 514 و647 نانومتر، حيث يتم تعاقب إثارة المانح والمستقبل بشكل متكرر مع وجود فاصل زمني أدنى قدره 1 مللي ثانية، يتبعه وقت تأخير يمكن تغييره وفقاً لمتطلبات التجربة.

للحصول على إشارة فلورية قوية بما يكفي للكشف عن صبغة واحدة في غضون أجزاء من الثانية من الإثارة، نحتاج إلى تطبيق كثافات قدرة إثارة عالية تتراوح بين 1 و 5 kilowatts per square centimeter. وبسبب التبييض الضوئي، ينخفض عدد جزيئات PMHC fret acceptor المرئية بسرعة إلى مستوى تصبح عنده قوى fluoro لـ fret acceptor المنفردة قابلة للتمييز في طبقة ثنائية تحتوي على 30 أو أكثر من PMCS الموصومة لكل square micron. ويظهر هنا مثال لتأخر زمني إجمالي قدره 42 milliseconds.

يظهر حدث FRET واحد، محدد بدائرة حمراء، في النقطتين الزمنيتين الثانية والثالثة. وهو يتوضع مشتركاً مع جزيء S5 واحد محدد بدائرة خضراء. في هذا المثال، يبلغ طول أثر حدث FRET الملحوظ اثنين؛ قم بجمع المزيد من آثار FRET للجزيء الواحد كما هو موضح في الجدول في بعض 128 أثراً.

بعد ذلك، احسب المجموع التراكمي التكميلي للآثار كما توضح الأرقام الخضراء وقم بتطبيعها كما هو موضح في رسم القيم المطبعة، ثم قم بمطابقتها باستخدام دالة أسية أحادية. القيمة المتوقعة تزيد قليلاً عن 1.5 إطارات زمنية. تعتمد هذه القيمة على ببتيد TCR، وارتباط MHC، والبهتان الضوئي؛ وللتمكن من التمييز بين هذين المساهمتين، يجب بالتالي حساب القيمة المتوقعة لثلاث فترات زمنية مختلفة على الأقل.

قم الآن برسم جميع قيم التوقع مقابل الفترات الزمنية المقابلة لها، وقم بمطابقة نقاط البيانات مع الدالة الموضحة التي تحتوي على عمر النصف هنا، وهو 2.12 ثانية، وقيمة التوقع لعملية PHOTOBLEACHING f Fred. يمكن استخدام استعادة المانح بعد عملية bleaching المقبولة لـ F Fred، كما هو موضح هنا وبمزيد من التفصيل مسبقًا، لتحديد ثوابت التفكك ثنائية الأبعاد في بضع خطوات فقط، وفقًا لفعاليتها داخل المشبك المناعي.

نركز هنا في تحليلنا على ارتباط TCR وتجمعات TCR حيث يكون ارتباط T-C-R-P-M-H-C أكثر بروزاً. وكما يتضح من القياسات المعروضة، تختلف قيم F FRED بشكل كبير بالنسبة لكل تجمع TCR على حدة.

يؤدي ضرب F fred في عامل التناسب C إلى الحصول على إشغال TCR، وهو مصطلح يصف النسبة بين عدد TCRs المرتبطة بـ PMHC وعددها الإجمالي. يجب تحديد C مرة واحدة لمجموعة محددة من أزواج fre ونظام FRE المستخدم. وفي نهاية هذا العرض التقديمي، سنشرح بمزيد من التفصيل كيفية تحديد C، على سبيل المثال، وهو ما يتضمن SI three و SI five الموضعين تحديداً على قطعة الجسم المضاد أحادي السلسلة التفاعلية TCR R والنهاية الكربونية C للببتيد المرتبط بـ MHC. ويصل ذلك إلى حوالي اثنين من ثوابت التفكك ثنائية الأبعاد في المشبك العصبي، والتي يمكن حسابها من إشغال TCR المسمى A والكثافة الأولية لـ pmcs الموجودة على الغشاء الدهني.

تم اشتقاق العلاقة المعروضة من قانون فعل الكتلة، وهي مشروحة بمزيد من التفصيل في المقال المصاحب لهذا الفيديو. في مثالنا، تبلغ الكثافة الأولية لـ pmcs مقدار 30 molecule per square micron. ونصل إلى توزيع لـ 2D kds، والتي تكون فعالة في المشبك التائي (T-cell synapse) بقيمة وسيطة تبلغ حوالي 34 molecule per square micron.

يمكن حساب توزيع معدل الارتباط (on rate) من توزيع KD ثنائي الأبعاد في التشابك العصبي ومعدل الانفصال (off rate) المقابل هنا، والذي يبلغ 0.41 في الثانية كما تم تحديده عبر تحليل آثار FRET للجزيء المنفرد عند 24 درجة مئوية. القيمة الوسيطة تبلغ حوالي 0.01 ميكرون مربع لكل جزيء في الثانية. وباختصار، تسمح قياسات FRET بين TCR و peptide MHC بإجراء تحليل شامل لجميع المعاملات الحركية التي تصف ديناميكيات التفاعل في C two.

يمكن تعميم هذه المنهجية من حيث المبدأ لتحليل تفاعلات أخرى بين المستقبِل والرابط، حيث قد تكون هذه التفاعلات جزءًا أساسيًا من عملية التعرف الخلوي-الخلوي. وأخيرًا، نناقش كيفية اشتقاق الثابت C تجريبيًا، وهو الثابت المطلوب لتحويل عوائد الدهون إلى نسب إشغال TCR. هذا الإجراء يجب تنفيذه مرة واحدة فقط.

يمكن بعد ذلك استخدام الثابت C الذي تم تحديده في جميع التجارب اللاحقة التي يتم فيها تطبيق نظام fret نفسه باستخدام الفلوروفورات نفسها. في هذا الإجراء، قمنا في الجوهر بربط إنتاجيات fret المقاسة في تجمعات TCR الفردية من خلال استعادة المانح بعد التبييض الضوئي للمستقبل بقيم الكثافة المقابلة المكتشفة في قناة fret المحسسة. وكما نوقش سابقاً، يتم تحديد إنتاجية fret من صور قناة مانح fret المصححة للخلفية قبل وبعد استئصال مستقبل fret.

يجب محاذاة قناة FRET المُحسَّسة مع قناة المانح F في المحورين X وY وتصحيحها بالنسبة للخلفية. يتم ذلك لمعالجة تسرُّب إشارة المانح F والإثارة المتبادلة للمستقبل F كما هو موضح هنا. يتوفر وصف تفصيلي لكيفية تصحيح تسرُّب إشارة المانح F والإثارة المتبادلة للمستقبل F في المقالة.

بالتزامن مع هذا الفيديو، قم بحساب نسبة إشارة bug في صورة fret المصححة إلى صورة مانح fret المصححة المقابلة لكل عنقود TCR. حدد متوسط الإشارة المصححة لمانحي fret المنفردين وأحداث fret للجزيء الواحد ثم احسب النسبة. بعد ذلك، يتم اشتقاق نسبة إشغال TCR عن طريق ضرب كلتا النسبتين.

الآن، قم برسم مخطط لعوائد FRET المحددة لكل عنقود TCR مقابل إشغالات TCR الخاصة بها. يتم بعد ذلك تحديد C من خلال الانحدار الخطي كما هو موضح هنا. في مثالنا، تبلغ القيمة حوالي 2.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على استخدام طبقة دهنية ثنائية وظيفية من البروتين بالاشتراك مع مجهر الفلورة للجزيء الواحد لقياس حركية الارتباط التشابكي بين PMHC و TCR. لقد تمت مناقشة جميع الخطوات الضرورية بما في ذلك إنتاج البروتين، ووسم الخلايا التائية، وقياسات FRET النهائية. علاوة على ذلك، تم عرض تحليل الصور بالتفصيل مما أدى إلى استخراج منحنيات تنشيط الخلايا التائية وقيم FRET.

أخيرًا، تم توضيح المنهجية التي تستند إليها عملية تحديد معدلات الارتباط والانفصال الحركية. ويمكن من حيث المبدأ استخدام نهج مماثل لتحديد تفاعلات أخرى بين ربيطات المستقبلات المشبكية، على الرغم من أن بعض التعديلات المناسبة قد تكون ضرورية.